REE Volumen 16(3) Riobamba sep. - dic. 2022
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
ISSN-impreso 1390-7581
ISSN-digital 2661-6742
Terapia fotodinámica antimicrobiana sobre Candida albicans en superficies acrílicas de
prótesis dentales. Estudio in vitro
Antimicrobial photodynamic therapy on Candida albicans on acrylic surfaces of dental
prostheses. In vitro study
https://doi.org/10.37135/ee.04.15.08
Autores:
María Alejandra Jarrín Ríos - https//orcid.org/0000-0002-6358-9962
Maria Fernanda Caicedo Breeddy - https//orcid.org/0000-0002-3118-196
Pablo Ruben Garrido Villavicencio1,2 - https//orcid.org/000-0002-5223-1017
Héctor Eduardo Cepeda Inca1,2 - https//orcid.org/0000-0003-0567-6096
Universidad Central del Ecuador, Quito-Ecuador.
Facultad de Odontología, Universidad de Sao Paulo, Sao Paulo-Brasil.
Autor de correspondencia: Héctor Eduardo Cepeda Inca, Facultad de Odontología, Universi-
dad Central del Ecuador, Avenida América, Quito Ecuador. Email: hecepeda@uce.edu.ec.
RESUMEN
Frecuentemente, se hayan especies del género Candida en la microbiota oral de los humanos.
Objetivo: comparar la efectividad antimicrobiana de la terapia fotodinámica sobre las cepas de
Candida albicans en superficies acrílicas para prótesis dentales, empleando láser con 660nm de
longitud de onda y azul de metileno como agente fotosensibilizador, con respecto a otros méto-
dos terapéuticos. Metodología: estudio in vitro, empleando 60 discos de acrílico de termocurado
sumergidos en una suspensión de C. albicans, generando una simulación de biofilm sobre la
superficie de una prótesis dental. Luego se conformaron cinco grupos al azar de 12 unidades a
los que se aplicó diferentes procedimientos terapéuticos: G1 (suero fisiológico), G2 (clorhexidi-
na al 0,12%), G3 (nistatina en solución tópica en 0,001ml/ul), G4 (azul de metileno al 0,005% +
-
tiva al comparar los grupos G4 y G5 con respecto a los G1 y G3 (p<0,05). Conclusión: la efica-
cia en la reducción del número de UFC viables de C. albicans resultó superior en los grupos
donde se empleó radiación láser con una longitud de onda de 660nm con diferentes concentra-
ciones de azul de metileno. El uso de nistatina y de suero fisiológico tuvieron los menores valo-
res de eficacia.
Palabras clave: fotoquimioterapia, terapia por láser, candidiasis bucal, prótesis dental.
ABSTRACT
Species of the genus Candida are frequently found in the oral microbiota of humans. Objective:
to compare the antimicrobial effectiveness of photodynamic therapy on Candida albicans
strains on acrylic surfaces for dental prostheses by using a 660nm wavelength laser and methyle-
ne blue as a photosensitizing agent, with respect to other therapeutic methods. Methodology: in
vitro study, using 60 thermosetting acrylic discs immersed in a suspension of C. albicans, gene-
rating a biofilm simulation on the surface of a dental prosthesis. After that, five random groups
of 12 units were formed to apply them different therapeutic procedures: G1 (saline solution), G2
(chlorhexidine 0.12%), G3 (nystatin in topical solution at 0.001ml/ul), G4 (0.005% methylene
observed when comparing groups G4 and G5 with respect to G1 and G3 (p<0.05). Conclusion:
the efficacy in reducing the number of viable C. albicans CFU was higher in the groups where
laser radiation with a wavelength of 660nm was used with different concentrations of methylene
blue. The use of nystatin and physiological saline had the lowest efficacy values.
Keywords: Photochemotherapy; Laser Therapy; Candidiasis, Oral; Dental Prosthesis.
INTRODUCCIÓN
Las especies del género Candida se hallan frecuentemente en la microbiota oral de los huma-
nos.(1) En la mayoría de los individuos, este microorganismo reside como un huésped inofensivo;
sin embargo, ante factores predisponentes, pueden causar infecciones que van desde lesiones
superficiales de la mucosa hasta procesos sistémicos que amenazan la vida.(2-4)
Candida albicans es un hongo dimórfico capaz de evadir los mecanismos de defensa del hués-
ped, permitiéndole colonizar el epitelio a través de la secreción de enzimas hidrolíticas tales
como: proteinasas y fosfolipasas; lo que produce metabolitos ácidos, otras sustancias tóxicas y
la transición fenotípica de blastosporas a hifas o pseudohifas.(1,5) Esa capacidad de adherencia
favorece el desarrollo de estomatitis por prótesis dental (EPD) que se puede agravar ante eleva-
do consumo de azúcar.(3)
El uso de prótesis dentales acrílicas se relaciona con infecciones por Candida albicans, princi-
palmente, si existe potencial contaminación por exceder la vida útil de la prótesis y una deficien-
te higiene oral.(1)
Este tipo de infección dificulta la alimentación debido a la presencia de sangrado y exudado,
acompañado de ardor, dolor, halitosis, gusto desagradable y sequedad bucal.(4)
El control de las infecciones por Candida albicans resulta difícil por su naturaleza multifacto-
rial.(4) El tratamiento más empleado se basa en la medicación mediante antifúngicos en diferen-
tes presentaciones: tabletas, enjuagues y antisépticos para la desinfección de la prótesis. Aunque,
se exploran otros tratamientos por el incremento de la resistencia microbiológica a los medica-
mentos de elección.(5,6)
La terapia fotodinámica (PDT, por sus siglas del inglés Photodynamic Therapy) constituye un
procedimiento terapéutico alternativo para la inactivación de microorganismos patógenos.(6,7)
Este consiste en la administración de un agente fotosensibilizante que se irradia con una longitud
de onda específica, produciéndose especies reactivas de oxígeno (ROS) que provocan la muerte
del hongo.(8,9)
Existen dos mecanimos para la producción de ROS:(10)
• Tipo I, mediante transferencia de electrones al O que produce: superóxido, peróxido de
hidrógeno e hidroxilo.
• Tipo II, a través de transferencia de energía que produce oxígeno singlete.
Al acumularse o atravesar la membrana citoplasmática, el agente fotosensibilizador provoca
daños irreversibles en las bacterias después de la irradiación. La efectividad de la PDT depende-
rá de la longitud de onda aplicada, la concentración el agente fotosensibilizador, el tiempo de
irradiación, la potencia de salida, el modo de irradiación (continuo o pulsado) y la convergencia
del haz de luz.(6,9)
Así, en el uso de PDT se emplea fuentes de luz roja (630nm-700nm) por la capacidad de las
longitudes de onda larga para penetrar efectivamente los tejidos biológicos, siendo preferible el
empleo de agentes fotosensibilizadores tales como: azul de metileno (AM), azul de toluidina
(AT) y el verde de malaquita (VM). Por otra parte, las fuentes de luz azul (380nm-520nm), utili-
zando como fotosensibilizadores: rosa de bengala (RB), eosina (EOS) y eritrosina (ERI).(9)
Considerando lo expuesto, la presente investigación tuvo el propósito de comparar la efectividad
antimicrobiana de la terapia fotodinámica sobre las cepas de C. albicans en superficies acrílicas
para prótesis dentales, empleando láser con 660nm de longitud de onda y azul de metileno como
agente fotosensibilizador, con respecto a otros métodos terapéuticos.
MATERIAL Y MÉTODOS
Se prepararon 60 discos de resina acrílica termopolimerizable de color rosado, el que se utiliza
habitualmente para la elaboración de prótesis dentales (MARCHE Termocurable, Santiago de
Chile) de 10 mm de diámetro y 3 mm de espesor, siguiendo las instrucciones del fabricante:
proporción de polvo/líquido 3.2:1 v/v). Este procedimiento se realizó siguiendo la técnica de
moldeo por compresión termopolimerizada, a partir de patrones de cera para modelar (Cera
Reus S.A Spain) con las mismas dimensiones, siendo enmuflados con yeso ISO tipo 3 (Rapid-
proceso térmico fue a 70ºC durante 90 minutos y luego a 100ºC por 30 minutos, para dejarse
enfriar durante 30 minutos. Cada muestra se pulió con papel de lija 600 para simular una superfi-
cie rugosa y se verificó las dimensiones de los discos mediante un paquímetro digital (TOTAL,
China). Finalmente, las muestras se esterilizaron en autoclave a 121ºC por 15 minutos.
Activación de las cepas
La activación de las cepas de Candida albicans se realizó en una cámara de flujo laminar
líquido de tripticasa soya; se dejó cultivar en una estufa (THELCO Thermo Electron Corpora-
tion USA) a 37°C por 48 horas y se evaluó el crecimiento por medición de la turbidez de 0,5 en
la escala de Mc Farland, equivalente a 1x108 unidades formadoras de colonias por mililitro.
Conformación de los grupos
El microorganismo activado se inoculó en los discos de acrílico colocando 2ml de caldo de culti-
vo en pocillos individuales y se llevó a incubación en una estufa (THELCO Thermo Electron
Corporation USA) a 37°C por 48 horas. Después del tiempo de incubación, cada uno de los
discos fueron colocados en pocillos individuales de cajas de cultivo estériles según los grupos
grupos en los que se aplicó 2 ml de cada sustancia estudiada durante 5 minutos: G1 suero fisioló-
gico, G2 clorhexidina al 0,12%, G3 Nistatina al 0,001 ml/ul, mientras que, en G4 y G5 se colocó
azul de metileno al 0,005% y 0,01%, respectivamente. Posterior, se eliminaron los excesos de
colorante y se irradiaron las superficies rugosas con un láser el diodo Therapy XT (DMC, São
90s, área del spot 0,028cm2 y una dosis de energía de 321J/cm2 a 1mm de distancia de forma
perpendicular en modo continuo.
Para garantizar que la energía sea constante en cada grupo, se verificó la potencia del láser
mediante un radiómetro (DMC, São Carlos/SP, Brazil) antes de realizar cada aplicación.
Siembra de los cultivos
A continuación, se hisopó la parte rugosa de cada disco, procediendo a inocular en medio de
cultivo Sabouraud a 37°C por 48 horas.
Las cepas de Candida albicans se cultivan con mayor rapidez en medios artificiales; así, durante
las primeras 24 horas ya se puedo observar colonias de aspecto cremoso, brillante y de color
blanco y entre las 48 y 72 horas se obtiene un nivel muy alto de desarrollo. Aun sin la presencia
de oxígeno, la incubación puede realizarse de 25 a 37°C con un nivel de riesgo de debilitar su
crecimiento.(11)
Conteo de las unidades formadoras de colonias (UFC)
Transcurridas 48 horas, se realizó el conteo de las UFC de cada una de las muestras para verifi-
car el nivel de crecimiento del microorganismo por cuadrantes, utilizando un contador de colo-
nias de campo oscuro con iluminación uniforme de las placas con un aumento de 3x (QUEBEC
Darfield Colony Counter 220V/50Hz Reichert Technologies EE.UU.) (figura 1). Los datos
relativos a estas se agruparon en cuatro rangos de escala para su mejor procesamiento según
grupos experimentales: 0 a 99, 100 a 199, 200 a 300 y mayor que 300.
Figura 1. Variación de resultados en el conteo de los diferentes grupos: 1A (suero fisiológico),
1B (clorhexidina), 1C (nistatina 0,001 ml/ul), 1D (AM 0,005%) 1E (AM 0,01%)
Los datos recolectados fueron organizados en una base elaborada en el programa Microsoft
Excel para su posterior procesamiento y análisis, mediante estadísticas descriptivas de frecuen-
Los investigadores siguieron los principios de la investigación científica, cumpliendo con las
medidas de seguridad para el trabajo en el laboratorio de microbiología y la obtención de los
correspondientes permisos. El estudio contó con el aval de la carrera de Odontología de la
Universidad Central del Ecuador.
RESULTADOS
El proceso investigativo posibilitó comparar la efectividad de diversos métodos terapéuticos de
desinfección de superficies acrílicas de prótesis dentales contaminadas por Candida albicans.
Tabla 1
*Diferencias estadísticamente significativas
Los resultados obtenidos mostraron que entre ambos grupos donde se aplicó la terapia fotodiná-
mica (G4 y G5) no existió diferencias significativas, contrariamente a los observado al comparar
los datos de estos con respecto a los grupos en los que se aplicó suero fisiológico y nistatina (G1
y G3, respectivamente), con valores (p<0,05) (tabla 1).
Figura 2. Comparación de los grupos atendiendo a rangos de los valores de UFC
Las muestras presentaron un mayor crecimiento de Cándida albicans fueron en las que se utilizó
suero fisiológico (G1) y nistatina (G3), con un 100% de los valores en el rango de > 300 ufc,
observándose la mejor efectividad en los grupos donde se aplicó la terapia fotodinámica (G4 y
G5).
DISCUSIÓN
En otras investigaciones(12,13) también se reportó adecuados niveles de eficacia de la PDT con el
uso de AM como agente fotosensibilizador en infecciones bacterianas y fúngicas en afectaciones
dermatológicas, gástricas y de la cavidad oral. Aunque, debe destacarse que los reportes publica-
dos mencionan que ni el agente fotosensibilizante ni la irradiación por sí solos tienen un efecto
antimicrobiano significativo en cepas de C. albicans.(10,13,14)
En la PDT, las ROS (anión superóxido, radical hidroxilo, peróxido de hidrogeno y especialmen-
te el oxígeno singleto) son las que generan el estrés oxidativo. Estas alteran la integridad celular,
dañando el ADN, los lípidos, las proteinas y otras macromoléculas, lo que causa la muerte por
necrosis o apotosis. Además, cuando son endógenas propician una transición alcalina del ADN,
provocando daños en las purinas y/o pirimidinas y roturas dobles o sencillas en las cadenas de
nucleótidos con un efecto tóxico y mutagénico sobre las células de C. albicans.(15,16)
La dosificación del fotosensibilizador constituye un factor determinante en la eficacia de la
PDT.(17) Esta se realiza atendiendo a sensibilidad y concentración, considerando los parámetros
de irradiación con luz y concentración de oxígeno molecular disponible.(14,17,18)
Este estudio, la irradiación con láser y AM como fotosensibilizador fue el método más eficaz en
la reducción de UFC de C. albicans, empleando longitudes de onda de 660nm tal como reco-
mienda Nuñez.(17)
Pupo(14) señala que el número de UFC de C. albicans iniciales puede reducirse hasta en un
(18) hallaron una
disminución del 42%, mientras que Sousa et al.(13) reportaron un 88,6%; además de otros auto-
res(16,19) que informan el efecto fungicida significativo de este método en C. albicans.
Pasyechnikova et al.(20) considera que una mayor concentración del agente fotosensibilizador
pudiera generar agregados, alterando su banda de absorción, lo que se ha sido descrito con
sustancias como el AM y el azul de toluidina (AT); Aunque, otro criterio indica que concentra-
ciones elevadas pueden crear una barrera que impediría la difusión adecuada de la luz.(17)
Con respecto al uso de nistatina como antifúngico en infecciones cutáneas y de la mucosa origi-
nadas por Candida albicans, esta actúa uniéndose a los esteroles de su membrana celular, afec-
tando su permeabilidad, lo que provoca la eliminación de elementos intracelulares vitales.(15,21)
Así, contrariamente a los resultados obtenidos en la presente investigación, Bakhtiari et al.(22)
La clorhexidina es un detergente catiónico soluble en agua que reacciona con los lipopolisacari-
dos y fosfolipidos de la membrana celular, inhibiendo la utilización de oxígeno y causando la
muerte celular.(21) Los hallazgos del presente estudio mostraron la efectividad de esta sustancia
fue superior a la nistatina para disminuir la viabilidad de las UFC de C. albicans.
CONCLUSIONES
En ambos grupos donde se empleó la terapia fotodinámica con diferentes concentraciones de
azul de metileno y la radiación láser con una longitud de onda de 660nm, la eficacia en la reduc-
ción del número de UFC viables de C. albicans sobre superficies acrílicas fue superior al uso de
otros métodos mediante la aplicación de sustancias antifúngicas. Los grupos uno (suero fisioló-
gico) y tres (nistatina) constituyeron los métodos con menores valores de eficacia al respecto.
Agradecimientos: a los funcionarios del laboratorio de microbiología de la Facultad de la
Bioquímica de la Universidad Central del Ecuador por su valioso aporte en esta investigación.
Conflicto de intereses: los autores declaran que no existe.
Declaración de contribución: existió una participación homogénea y activa en la investiga-
ción, recolección de información científica actualizada y la redacción del artículo.
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Recibido: 19 de enero de 2022
Aprobado: 24 de marzo de 2022
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Terapia fotodinámica antimicrobiana sobre Candida albicans en superficies acrílicas de
prótesis dentales. Estudio in vitro
Antimicrobial photodynamic therapy on Candida albicans on acrylic surfaces of dental
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Autores:
María Alejandra Jarrín Ríos - https//orcid.org/0000-0002-6358-9962
Maria Fernanda Caicedo Breeddy - https//orcid.org/0000-0002-3118-196
Pablo Ruben Garrido Villavicencio1,2 - https//orcid.org/000-0002-5223-1017
Héctor Eduardo Cepeda Inca1,2 - https//orcid.org/0000-0003-0567-6096
Universidad Central del Ecuador, Quito-Ecuador.
Facultad de Odontología, Universidad de Sao Paulo, Sao Paulo-Brasil.
Autor de correspondencia: Héctor Eduardo Cepeda Inca, Facultad de Odontología, Universi-
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RESUMEN
Frecuentemente, se hayan especies del género Candida en la microbiota oral de los humanos.
Objetivo: comparar la efectividad antimicrobiana de la terapia fotodinámica sobre las cepas de
Candida albicans en superficies acrílicas para prótesis dentales, empleando láser con 660nm de
longitud de onda y azul de metileno como agente fotosensibilizador, con respecto a otros méto-
dos terapéuticos. Metodología: estudio in vitro, empleando 60 discos de acrílico de termocurado
sumergidos en una suspensión de C. albicans, generando una simulación de biofilm sobre la
superficie de una prótesis dental. Luego se conformaron cinco grupos al azar de 12 unidades a
los que se aplicó diferentes procedimientos terapéuticos: G1 (suero fisiológico), G2 (clorhexidi-
na al 0,12%), G3 (nistatina en solución tópica en 0,001ml/ul), G4 (azul de metileno al 0,005% +
-
tiva al comparar los grupos G4 y G5 con respecto a los G1 y G3 (p<0,05). Conclusión: la efica-
cia en la reducción del número de UFC viables de C. albicans resultó superior en los grupos
donde se empleó radiación láser con una longitud de onda de 660nm con diferentes concentra-
ciones de azul de metileno. El uso de nistatina y de suero fisiológico tuvieron los menores valo-
res de eficacia.
Palabras clave: fotoquimioterapia, terapia por láser, candidiasis bucal, prótesis dental.
ABSTRACT
Species of the genus Candida are frequently found in the oral microbiota of humans. Objective:
to compare the antimicrobial effectiveness of photodynamic therapy on Candida albicans
strains on acrylic surfaces for dental prostheses by using a 660nm wavelength laser and methyle-
ne blue as a photosensitizing agent, with respect to other therapeutic methods. Methodology: in
vitro study, using 60 thermosetting acrylic discs immersed in a suspension of C. albicans, gene-
rating a biofilm simulation on the surface of a dental prosthesis. After that, five random groups
of 12 units were formed to apply them different therapeutic procedures: G1 (saline solution), G2
(chlorhexidine 0.12%), G3 (nystatin in topical solution at 0.001ml/ul), G4 (0.005% methylene
observed when comparing groups G4 and G5 with respect to G1 and G3 (p<0.05). Conclusion:
the efficacy in reducing the number of viable C. albicans CFU was higher in the groups where
laser radiation with a wavelength of 660nm was used with different concentrations of methylene
blue. The use of nystatin and physiological saline had the lowest efficacy values.
Keywords: Photochemotherapy; Laser Therapy; Candidiasis, Oral; Dental Prosthesis.
INTRODUCCIÓN
Las especies del género Candida se hallan frecuentemente en la microbiota oral de los huma-
nos.(1) En la mayoría de los individuos, este microorganismo reside como un huésped inofensivo;
sin embargo, ante factores predisponentes, pueden causar infecciones que van desde lesiones
superficiales de la mucosa hasta procesos sistémicos que amenazan la vida.(2-4)
Candida albicans es un hongo dimórfico capaz de evadir los mecanismos de defensa del hués-
ped, permitiéndole colonizar el epitelio a través de la secreción de enzimas hidrolíticas tales
como: proteinasas y fosfolipasas; lo que produce metabolitos ácidos, otras sustancias tóxicas y
la transición fenotípica de blastosporas a hifas o pseudohifas.(1,5) Esa capacidad de adherencia
favorece el desarrollo de estomatitis por prótesis dental (EPD) que se puede agravar ante eleva-
do consumo de azúcar.(3)
El uso de prótesis dentales acrílicas se relaciona con infecciones por Candida albicans, princi-
palmente, si existe potencial contaminación por exceder la vida útil de la prótesis y una deficien-
te higiene oral.(1)
Este tipo de infección dificulta la alimentación debido a la presencia de sangrado y exudado,
acompañado de ardor, dolor, halitosis, gusto desagradable y sequedad bucal.(4)
El control de las infecciones por Candida albicans resulta difícil por su naturaleza multifacto-
rial.(4) El tratamiento más empleado se basa en la medicación mediante antifúngicos en diferen-
tes presentaciones: tabletas, enjuagues y antisépticos para la desinfección de la prótesis. Aunque,
se exploran otros tratamientos por el incremento de la resistencia microbiológica a los medica-
mentos de elección.(5,6)
La terapia fotodinámica (PDT, por sus siglas del inglés Photodynamic Therapy) constituye un
procedimiento terapéutico alternativo para la inactivación de microorganismos patógenos.(6,7)
Este consiste en la administración de un agente fotosensibilizante que se irradia con una longitud
de onda específica, produciéndose especies reactivas de oxígeno (ROS) que provocan la muerte
del hongo.(8,9)
Existen dos mecanimos para la producción de ROS:(10)
• Tipo I, mediante transferencia de electrones al O que produce: superóxido, peróxido de
hidrógeno e hidroxilo.
• Tipo II, a través de transferencia de energía que produce oxígeno singlete.
Al acumularse o atravesar la membrana citoplasmática, el agente fotosensibilizador provoca
daños irreversibles en las bacterias después de la irradiación. La efectividad de la PDT depende-
rá de la longitud de onda aplicada, la concentración el agente fotosensibilizador, el tiempo de
irradiación, la potencia de salida, el modo de irradiación (continuo o pulsado) y la convergencia
del haz de luz.(6,9)
Así, en el uso de PDT se emplea fuentes de luz roja (630nm-700nm) por la capacidad de las
longitudes de onda larga para penetrar efectivamente los tejidos biológicos, siendo preferible el
empleo de agentes fotosensibilizadores tales como: azul de metileno (AM), azul de toluidina
(AT) y el verde de malaquita (VM). Por otra parte, las fuentes de luz azul (380nm-520nm), utili-
zando como fotosensibilizadores: rosa de bengala (RB), eosina (EOS) y eritrosina (ERI).(9)
Considerando lo expuesto, la presente investigación tuvo el propósito de comparar la efectividad
antimicrobiana de la terapia fotodinámica sobre las cepas de C. albicans en superficies acrílicas
para prótesis dentales, empleando láser con 660nm de longitud de onda y azul de metileno como
agente fotosensibilizador, con respecto a otros métodos terapéuticos.
MATERIAL Y MÉTODOS
Se prepararon 60 discos de resina acrílica termopolimerizable de color rosado, el que se utiliza
habitualmente para la elaboración de prótesis dentales (MARCHE Termocurable, Santiago de
Chile) de 10 mm de diámetro y 3 mm de espesor, siguiendo las instrucciones del fabricante:
proporción de polvo/líquido 3.2:1 v/v). Este procedimiento se realizó siguiendo la técnica de
moldeo por compresión termopolimerizada, a partir de patrones de cera para modelar (Cera
Reus S.A Spain) con las mismas dimensiones, siendo enmuflados con yeso ISO tipo 3 (Rapid-
proceso térmico fue a 70ºC durante 90 minutos y luego a 100ºC por 30 minutos, para dejarse
enfriar durante 30 minutos. Cada muestra se pulió con papel de lija 600 para simular una superfi-
cie rugosa y se verificó las dimensiones de los discos mediante un paquímetro digital (TOTAL,
China). Finalmente, las muestras se esterilizaron en autoclave a 121ºC por 15 minutos.
Activación de las cepas
La activación de las cepas de Candida albicans se realizó en una cámara de flujo laminar
líquido de tripticasa soya; se dejó cultivar en una estufa (THELCO Thermo Electron Corpora-
tion USA) a 37°C por 48 horas y se evaluó el crecimiento por medición de la turbidez de 0,5 en
la escala de Mc Farland, equivalente a 1x108 unidades formadoras de colonias por mililitro.
Conformación de los grupos
El microorganismo activado se inoculó en los discos de acrílico colocando 2ml de caldo de culti-
vo en pocillos individuales y se llevó a incubación en una estufa (THELCO Thermo Electron
Corporation USA) a 37°C por 48 horas. Después del tiempo de incubación, cada uno de los
discos fueron colocados en pocillos individuales de cajas de cultivo estériles según los grupos
grupos en los que se aplicó 2 ml de cada sustancia estudiada durante 5 minutos: G1 suero fisioló-
gico, G2 clorhexidina al 0,12%, G3 Nistatina al 0,001 ml/ul, mientras que, en G4 y G5 se colocó
azul de metileno al 0,005% y 0,01%, respectivamente. Posterior, se eliminaron los excesos de
colorante y se irradiaron las superficies rugosas con un láser el diodo Therapy XT (DMC, São
90s, área del spot 0,028cm2 y una dosis de energía de 321J/cm2 a 1mm de distancia de forma
perpendicular en modo continuo.
Para garantizar que la energía sea constante en cada grupo, se verificó la potencia del láser
mediante un radiómetro (DMC, São Carlos/SP, Brazil) antes de realizar cada aplicación.
Siembra de los cultivos
A continuación, se hisopó la parte rugosa de cada disco, procediendo a inocular en medio de
cultivo Sabouraud a 37°C por 48 horas.
Las cepas de Candida albicans se cultivan con mayor rapidez en medios artificiales; así, durante
las primeras 24 horas ya se puedo observar colonias de aspecto cremoso, brillante y de color
blanco y entre las 48 y 72 horas se obtiene un nivel muy alto de desarrollo. Aun sin la presencia
de oxígeno, la incubación puede realizarse de 25 a 37°C con un nivel de riesgo de debilitar su
crecimiento.(11)
Conteo de las unidades formadoras de colonias (UFC)
Transcurridas 48 horas, se realizó el conteo de las UFC de cada una de las muestras para verifi-
car el nivel de crecimiento del microorganismo por cuadrantes, utilizando un contador de colo-
nias de campo oscuro con iluminación uniforme de las placas con un aumento de 3x (QUEBEC
Darfield Colony Counter 220V/50Hz Reichert Technologies EE.UU.) (figura 1). Los datos
relativos a estas se agruparon en cuatro rangos de escala para su mejor procesamiento según
grupos experimentales: 0 a 99, 100 a 199, 200 a 300 y mayor que 300.
Figura 1. Variación de resultados en el conteo de los diferentes grupos: 1A (suero fisiológico),
1B (clorhexidina), 1C (nistatina 0,001 ml/ul), 1D (AM 0,005%) 1E (AM 0,01%)
Los datos recolectados fueron organizados en una base elaborada en el programa Microsoft
Excel para su posterior procesamiento y análisis, mediante estadísticas descriptivas de frecuen-
Los investigadores siguieron los principios de la investigación científica, cumpliendo con las
medidas de seguridad para el trabajo en el laboratorio de microbiología y la obtención de los
correspondientes permisos. El estudio contó con el aval de la carrera de Odontología de la
Universidad Central del Ecuador.
RESULTADOS
El proceso investigativo posibilitó comparar la efectividad de diversos métodos terapéuticos de
desinfección de superficies acrílicas de prótesis dentales contaminadas por Candida albicans.
Tabla 1
*Diferencias estadísticamente significativas
Los resultados obtenidos mostraron que entre ambos grupos donde se aplicó la terapia fotodiná-
mica (G4 y G5) no existió diferencias significativas, contrariamente a los observado al comparar
los datos de estos con respecto a los grupos en los que se aplicó suero fisiológico y nistatina (G1
y G3, respectivamente), con valores (p<0,05) (tabla 1).
Figura 2. Comparación de los grupos atendiendo a rangos de los valores de UFC
Las muestras presentaron un mayor crecimiento de Cándida albicans fueron en las que se utilizó
suero fisiológico (G1) y nistatina (G3), con un 100% de los valores en el rango de > 300 ufc,
observándose la mejor efectividad en los grupos donde se aplicó la terapia fotodinámica (G4 y
G5).
DISCUSIÓN
En otras investigaciones(12,13) también se reportó adecuados niveles de eficacia de la PDT con el
uso de AM como agente fotosensibilizador en infecciones bacterianas y fúngicas en afectaciones
dermatológicas, gástricas y de la cavidad oral. Aunque, debe destacarse que los reportes publica-
dos mencionan que ni el agente fotosensibilizante ni la irradiación por sí solos tienen un efecto
antimicrobiano significativo en cepas de C. albicans.(10,13,14)
En la PDT, las ROS (anión superóxido, radical hidroxilo, peróxido de hidrogeno y especialmen-
te el oxígeno singleto) son las que generan el estrés oxidativo. Estas alteran la integridad celular,
dañando el ADN, los lípidos, las proteinas y otras macromoléculas, lo que causa la muerte por
necrosis o apotosis. Además, cuando son endógenas propician una transición alcalina del ADN,
provocando daños en las purinas y/o pirimidinas y roturas dobles o sencillas en las cadenas de
nucleótidos con un efecto tóxico y mutagénico sobre las células de C. albicans.(15,16)
La dosificación del fotosensibilizador constituye un factor determinante en la eficacia de la
PDT.(17) Esta se realiza atendiendo a sensibilidad y concentración, considerando los parámetros
de irradiación con luz y concentración de oxígeno molecular disponible.(14,17,18)
Este estudio, la irradiación con láser y AM como fotosensibilizador fue el método más eficaz en
la reducción de UFC de C. albicans, empleando longitudes de onda de 660nm tal como reco-
mienda Nuñez.(17)
Pupo(14) señala que el número de UFC de C. albicans iniciales puede reducirse hasta en un
(18) hallaron una
disminución del 42%, mientras que Sousa et al.(13) reportaron un 88,6%; además de otros auto-
res(16,19) que informan el efecto fungicida significativo de este método en C. albicans.
Pasyechnikova et al.(20) considera que una mayor concentración del agente fotosensibilizador
pudiera generar agregados, alterando su banda de absorción, lo que se ha sido descrito con
sustancias como el AM y el azul de toluidina (AT); Aunque, otro criterio indica que concentra-
ciones elevadas pueden crear una barrera que impediría la difusión adecuada de la luz.(17)
Con respecto al uso de nistatina como antifúngico en infecciones cutáneas y de la mucosa origi-
nadas por Candida albicans, esta actúa uniéndose a los esteroles de su membrana celular, afec-
tando su permeabilidad, lo que provoca la eliminación de elementos intracelulares vitales.(15,21)
Así, contrariamente a los resultados obtenidos en la presente investigación, Bakhtiari et al.(22)
La clorhexidina es un detergente catiónico soluble en agua que reacciona con los lipopolisacari-
dos y fosfolipidos de la membrana celular, inhibiendo la utilización de oxígeno y causando la
muerte celular.(21) Los hallazgos del presente estudio mostraron la efectividad de esta sustancia
fue superior a la nistatina para disminuir la viabilidad de las UFC de C. albicans.
CONCLUSIONES
En ambos grupos donde se empleó la terapia fotodinámica con diferentes concentraciones de
azul de metileno y la radiación láser con una longitud de onda de 660nm, la eficacia en la reduc-
ción del número de UFC viables de C. albicans sobre superficies acrílicas fue superior al uso de
otros métodos mediante la aplicación de sustancias antifúngicas. Los grupos uno (suero fisioló-
gico) y tres (nistatina) constituyeron los métodos con menores valores de eficacia al respecto.
Agradecimientos: a los funcionarios del laboratorio de microbiología de la Facultad de la
Bioquímica de la Universidad Central del Ecuador por su valioso aporte en esta investigación.
Conflicto de intereses: los autores declaran que no existe.
Declaración de contribución: existió una participación homogénea y activa en la investiga-
ción, recolección de información científica actualizada y la redacción del artículo.
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Recibido: 19 de enero de 2022
Aprobado: 24 de marzo de 2022
REE Volumen 16(3) Riobamba sep. - dic. 2022
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
ISSN-impreso 1390-7581
ISSN-digital 2661-6742
Terapia fotodinámica antimicrobiana sobre Candida albicans en superficies acrílicas de
prótesis dentales. Estudio in vitro
Antimicrobial photodynamic therapy on Candida albicans on acrylic surfaces of dental
prostheses. In vitro study
https://doi.org/10.37135/ee.04.15.08
Autores:
María Alejandra Jarrín Ríos - https//orcid.org/0000-0002-6358-9962
Maria Fernanda Caicedo Breeddy - https//orcid.org/0000-0002-3118-196
Pablo Ruben Garrido Villavicencio1,2 - https//orcid.org/000-0002-5223-1017
Héctor Eduardo Cepeda Inca1,2 - https//orcid.org/0000-0003-0567-6096
Universidad Central del Ecuador, Quito-Ecuador.
Facultad de Odontología, Universidad de Sao Paulo, Sao Paulo-Brasil.
Autor de correspondencia: Héctor Eduardo Cepeda Inca, Facultad de Odontología, Universi-
dad Central del Ecuador, Avenida América, Quito Ecuador. Email: hecepeda@uce.edu.ec.
RESUMEN
Frecuentemente, se hayan especies del género Candida en la microbiota oral de los humanos.
Objetivo: comparar la efectividad antimicrobiana de la terapia fotodinámica sobre las cepas de
Candida albicans en superficies acrílicas para prótesis dentales, empleando láser con 660nm de
longitud de onda y azul de metileno como agente fotosensibilizador, con respecto a otros méto-
dos terapéuticos. Metodología: estudio in vitro, empleando 60 discos de acrílico de termocurado
sumergidos en una suspensión de C. albicans, generando una simulación de biofilm sobre la
superficie de una prótesis dental. Luego se conformaron cinco grupos al azar de 12 unidades a
los que se aplicó diferentes procedimientos terapéuticos: G1 (suero fisiológico), G2 (clorhexidi-
na al 0,12%), G3 (nistatina en solución tópica en 0,001ml/ul), G4 (azul de metileno al 0,005% +
-
tiva al comparar los grupos G4 y G5 con respecto a los G1 y G3 (p<0,05). Conclusión: la efica-
cia en la reducción del número de UFC viables de C. albicans resultó superior en los grupos
donde se empleó radiación láser con una longitud de onda de 660nm con diferentes concentra-
ciones de azul de metileno. El uso de nistatina y de suero fisiológico tuvieron los menores valo-
res de eficacia.
Palabras clave: fotoquimioterapia, terapia por láser, candidiasis bucal, prótesis dental.
ABSTRACT
Species of the genus Candida are frequently found in the oral microbiota of humans. Objective:
to compare the antimicrobial effectiveness of photodynamic therapy on Candida albicans
strains on acrylic surfaces for dental prostheses by using a 660nm wavelength laser and methyle-
ne blue as a photosensitizing agent, with respect to other therapeutic methods. Methodology: in
vitro study, using 60 thermosetting acrylic discs immersed in a suspension of C. albicans, gene-
rating a biofilm simulation on the surface of a dental prosthesis. After that, five random groups
of 12 units were formed to apply them different therapeutic procedures: G1 (saline solution), G2
(chlorhexidine 0.12%), G3 (nystatin in topical solution at 0.001ml/ul), G4 (0.005% methylene
observed when comparing groups G4 and G5 with respect to G1 and G3 (p<0.05). Conclusion:
the efficacy in reducing the number of viable C. albicans CFU was higher in the groups where
laser radiation with a wavelength of 660nm was used with different concentrations of methylene
blue. The use of nystatin and physiological saline had the lowest efficacy values.
Keywords: Photochemotherapy; Laser Therapy; Candidiasis, Oral; Dental Prosthesis.
INTRODUCCIÓN
Las especies del género Candida se hallan frecuentemente en la microbiota oral de los huma-
nos.(1) En la mayoría de los individuos, este microorganismo reside como un huésped inofensivo;
sin embargo, ante factores predisponentes, pueden causar infecciones que van desde lesiones
superficiales de la mucosa hasta procesos sistémicos que amenazan la vida.(2-4)
Candida albicans es un hongo dimórfico capaz de evadir los mecanismos de defensa del hués-
ped, permitiéndole colonizar el epitelio a través de la secreción de enzimas hidrolíticas tales
como: proteinasas y fosfolipasas; lo que produce metabolitos ácidos, otras sustancias tóxicas y
la transición fenotípica de blastosporas a hifas o pseudohifas.(1,5) Esa capacidad de adherencia
favorece el desarrollo de estomatitis por prótesis dental (EPD) que se puede agravar ante eleva-
do consumo de azúcar.(3)
El uso de prótesis dentales acrílicas se relaciona con infecciones por Candida albicans, princi-
palmente, si existe potencial contaminación por exceder la vida útil de la prótesis y una deficien-
te higiene oral.(1)
Este tipo de infección dificulta la alimentación debido a la presencia de sangrado y exudado,
acompañado de ardor, dolor, halitosis, gusto desagradable y sequedad bucal.(4)
El control de las infecciones por Candida albicans resulta difícil por su naturaleza multifacto-
rial.(4) El tratamiento más empleado se basa en la medicación mediante antifúngicos en diferen-
tes presentaciones: tabletas, enjuagues y antisépticos para la desinfección de la prótesis. Aunque,
se exploran otros tratamientos por el incremento de la resistencia microbiológica a los medica-
mentos de elección.(5,6)
La terapia fotodinámica (PDT, por sus siglas del inglés Photodynamic Therapy) constituye un
procedimiento terapéutico alternativo para la inactivación de microorganismos patógenos.(6,7)
Este consiste en la administración de un agente fotosensibilizante que se irradia con una longitud
de onda específica, produciéndose especies reactivas de oxígeno (ROS) que provocan la muerte
del hongo.(8,9)
Existen dos mecanimos para la producción de ROS:(10)
• Tipo I, mediante transferencia de electrones al O que produce: superóxido, peróxido de
hidrógeno e hidroxilo.
• Tipo II, a través de transferencia de energía que produce oxígeno singlete.
Al acumularse o atravesar la membrana citoplasmática, el agente fotosensibilizador provoca
daños irreversibles en las bacterias después de la irradiación. La efectividad de la PDT depende-
rá de la longitud de onda aplicada, la concentración el agente fotosensibilizador, el tiempo de
irradiación, la potencia de salida, el modo de irradiación (continuo o pulsado) y la convergencia
del haz de luz.(6,9)
Así, en el uso de PDT se emplea fuentes de luz roja (630nm-700nm) por la capacidad de las
longitudes de onda larga para penetrar efectivamente los tejidos biológicos, siendo preferible el
empleo de agentes fotosensibilizadores tales como: azul de metileno (AM), azul de toluidina
(AT) y el verde de malaquita (VM). Por otra parte, las fuentes de luz azul (380nm-520nm), utili-
zando como fotosensibilizadores: rosa de bengala (RB), eosina (EOS) y eritrosina (ERI).(9)
Considerando lo expuesto, la presente investigación tuvo el propósito de comparar la efectividad
antimicrobiana de la terapia fotodinámica sobre las cepas de C. albicans en superficies acrílicas
para prótesis dentales, empleando láser con 660nm de longitud de onda y azul de metileno como
agente fotosensibilizador, con respecto a otros métodos terapéuticos.
MATERIAL Y MÉTODOS
Se prepararon 60 discos de resina acrílica termopolimerizable de color rosado, el que se utiliza
habitualmente para la elaboración de prótesis dentales (MARCHE Termocurable, Santiago de
Chile) de 10 mm de diámetro y 3 mm de espesor, siguiendo las instrucciones del fabricante:
proporción de polvo/líquido 3.2:1 v/v). Este procedimiento se realizó siguiendo la técnica de
moldeo por compresión termopolimerizada, a partir de patrones de cera para modelar (Cera
Reus S.A Spain) con las mismas dimensiones, siendo enmuflados con yeso ISO tipo 3 (Rapid-
proceso térmico fue a 70ºC durante 90 minutos y luego a 100ºC por 30 minutos, para dejarse
enfriar durante 30 minutos. Cada muestra se pulió con papel de lija 600 para simular una superfi-
cie rugosa y se verificó las dimensiones de los discos mediante un paquímetro digital (TOTAL,
China). Finalmente, las muestras se esterilizaron en autoclave a 121ºC por 15 minutos.
Activación de las cepas
La activación de las cepas de Candida albicans se realizó en una cámara de flujo laminar
líquido de tripticasa soya; se dejó cultivar en una estufa (THELCO Thermo Electron Corpora-
tion USA) a 37°C por 48 horas y se evaluó el crecimiento por medición de la turbidez de 0,5 en
la escala de Mc Farland, equivalente a 1x108 unidades formadoras de colonias por mililitro.
Conformación de los grupos
El microorganismo activado se inoculó en los discos de acrílico colocando 2ml de caldo de culti-
vo en pocillos individuales y se llevó a incubación en una estufa (THELCO Thermo Electron
Corporation USA) a 37°C por 48 horas. Después del tiempo de incubación, cada uno de los
discos fueron colocados en pocillos individuales de cajas de cultivo estériles según los grupos
grupos en los que se aplicó 2 ml de cada sustancia estudiada durante 5 minutos: G1 suero fisioló-
gico, G2 clorhexidina al 0,12%, G3 Nistatina al 0,001 ml/ul, mientras que, en G4 y G5 se colocó
azul de metileno al 0,005% y 0,01%, respectivamente. Posterior, se eliminaron los excesos de
colorante y se irradiaron las superficies rugosas con un láser el diodo Therapy XT (DMC, São
90s, área del spot 0,028cm2 y una dosis de energía de 321J/cm2 a 1mm de distancia de forma
perpendicular en modo continuo.
Para garantizar que la energía sea constante en cada grupo, se verificó la potencia del láser
mediante un radiómetro (DMC, São Carlos/SP, Brazil) antes de realizar cada aplicación.
Siembra de los cultivos
A continuación, se hisopó la parte rugosa de cada disco, procediendo a inocular en medio de
cultivo Sabouraud a 37°C por 48 horas.
Las cepas de Candida albicans se cultivan con mayor rapidez en medios artificiales; así, durante
las primeras 24 horas ya se puedo observar colonias de aspecto cremoso, brillante y de color
blanco y entre las 48 y 72 horas se obtiene un nivel muy alto de desarrollo. Aun sin la presencia
de oxígeno, la incubación puede realizarse de 25 a 37°C con un nivel de riesgo de debilitar su
crecimiento.(11)
Conteo de las unidades formadoras de colonias (UFC)
Transcurridas 48 horas, se realizó el conteo de las UFC de cada una de las muestras para verifi-
car el nivel de crecimiento del microorganismo por cuadrantes, utilizando un contador de colo-
nias de campo oscuro con iluminación uniforme de las placas con un aumento de 3x (QUEBEC
Darfield Colony Counter 220V/50Hz Reichert Technologies EE.UU.) (figura 1). Los datos
relativos a estas se agruparon en cuatro rangos de escala para su mejor procesamiento según
grupos experimentales: 0 a 99, 100 a 199, 200 a 300 y mayor que 300.
Figura 1. Variación de resultados en el conteo de los diferentes grupos: 1A (suero fisiológico),
1B (clorhexidina), 1C (nistatina 0,001 ml/ul), 1D (AM 0,005%) 1E (AM 0,01%)
Los datos recolectados fueron organizados en una base elaborada en el programa Microsoft
Excel para su posterior procesamiento y análisis, mediante estadísticas descriptivas de frecuen-
Los investigadores siguieron los principios de la investigación científica, cumpliendo con las
medidas de seguridad para el trabajo en el laboratorio de microbiología y la obtención de los
correspondientes permisos. El estudio contó con el aval de la carrera de Odontología de la
Universidad Central del Ecuador.
RESULTADOS
El proceso investigativo posibilitó comparar la efectividad de diversos métodos terapéuticos de
desinfección de superficies acrílicas de prótesis dentales contaminadas por Candida albicans.
Tabla 1
*Diferencias estadísticamente significativas
Los resultados obtenidos mostraron que entre ambos grupos donde se aplicó la terapia fotodiná-
mica (G4 y G5) no existió diferencias significativas, contrariamente a los observado al comparar
los datos de estos con respecto a los grupos en los que se aplicó suero fisiológico y nistatina (G1
y G3, respectivamente), con valores (p<0,05) (tabla 1).
Figura 2. Comparación de los grupos atendiendo a rangos de los valores de UFC
Las muestras presentaron un mayor crecimiento de Cándida albicans fueron en las que se utilizó
suero fisiológico (G1) y nistatina (G3), con un 100% de los valores en el rango de > 300 ufc,
observándose la mejor efectividad en los grupos donde se aplicó la terapia fotodinámica (G4 y
G5).
DISCUSIÓN
En otras investigaciones(12,13) también se reportó adecuados niveles de eficacia de la PDT con el
uso de AM como agente fotosensibilizador en infecciones bacterianas y fúngicas en afectaciones
dermatológicas, gástricas y de la cavidad oral. Aunque, debe destacarse que los reportes publica-
dos mencionan que ni el agente fotosensibilizante ni la irradiación por sí solos tienen un efecto
antimicrobiano significativo en cepas de C. albicans.(10,13,14)
En la PDT, las ROS (anión superóxido, radical hidroxilo, peróxido de hidrogeno y especialmen-
te el oxígeno singleto) son las que generan el estrés oxidativo. Estas alteran la integridad celular,
dañando el ADN, los lípidos, las proteinas y otras macromoléculas, lo que causa la muerte por
necrosis o apotosis. Además, cuando son endógenas propician una transición alcalina del ADN,
provocando daños en las purinas y/o pirimidinas y roturas dobles o sencillas en las cadenas de
nucleótidos con un efecto tóxico y mutagénico sobre las células de C. albicans.(15,16)
La dosificación del fotosensibilizador constituye un factor determinante en la eficacia de la
PDT.(17) Esta se realiza atendiendo a sensibilidad y concentración, considerando los parámetros
de irradiación con luz y concentración de oxígeno molecular disponible.(14,17,18)
Este estudio, la irradiación con láser y AM como fotosensibilizador fue el método más eficaz en
la reducción de UFC de C. albicans, empleando longitudes de onda de 660nm tal como reco-
mienda Nuñez.(17)
Pupo(14) señala que el número de UFC de C. albicans iniciales puede reducirse hasta en un
(18) hallaron una
disminución del 42%, mientras que Sousa et al.(13) reportaron un 88,6%; además de otros auto-
res(16,19) que informan el efecto fungicida significativo de este método en C. albicans.
Pasyechnikova et al.(20) considera que una mayor concentración del agente fotosensibilizador
pudiera generar agregados, alterando su banda de absorción, lo que se ha sido descrito con
sustancias como el AM y el azul de toluidina (AT); Aunque, otro criterio indica que concentra-
ciones elevadas pueden crear una barrera que impediría la difusión adecuada de la luz.(17)
Con respecto al uso de nistatina como antifúngico en infecciones cutáneas y de la mucosa origi-
nadas por Candida albicans, esta actúa uniéndose a los esteroles de su membrana celular, afec-
tando su permeabilidad, lo que provoca la eliminación de elementos intracelulares vitales.(15,21)
Así, contrariamente a los resultados obtenidos en la presente investigación, Bakhtiari et al.(22)
La clorhexidina es un detergente catiónico soluble en agua que reacciona con los lipopolisacari-
dos y fosfolipidos de la membrana celular, inhibiendo la utilización de oxígeno y causando la
muerte celular.(21) Los hallazgos del presente estudio mostraron la efectividad de esta sustancia
fue superior a la nistatina para disminuir la viabilidad de las UFC de C. albicans.
CONCLUSIONES
En ambos grupos donde se empleó la terapia fotodinámica con diferentes concentraciones de
azul de metileno y la radiación láser con una longitud de onda de 660nm, la eficacia en la reduc-
ción del número de UFC viables de C. albicans sobre superficies acrílicas fue superior al uso de
otros métodos mediante la aplicación de sustancias antifúngicas. Los grupos uno (suero fisioló-
gico) y tres (nistatina) constituyeron los métodos con menores valores de eficacia al respecto.
Agradecimientos: a los funcionarios del laboratorio de microbiología de la Facultad de la
Bioquímica de la Universidad Central del Ecuador por su valioso aporte en esta investigación.
Conflicto de intereses: los autores declaran que no existe.
Declaración de contribución: existió una participación homogénea y activa en la investiga-
ción, recolección de información científica actualizada y la redacción del artículo.
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Recibido: 19 de enero de 2022
Aprobado: 24 de marzo de 2022
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
REE Volumen 16(3) Riobamba sep. - dic. 2022
ISSN-impreso 1390-7581
ISSN-digital 2661-6742
Terapia fotodinámica antimicrobiana sobre Candida albicans en superficies acrílicas de
prótesis dentales. Estudio in vitro
Antimicrobial photodynamic therapy on Candida albicans on acrylic surfaces of dental
prostheses. In vitro study
https://doi.org/10.37135/ee.04.15.08
Autores:
María Alejandra Jarrín Ríos - https//orcid.org/0000-0002-6358-9962
Maria Fernanda Caicedo Breeddy - https//orcid.org/0000-0002-3118-196
Pablo Ruben Garrido Villavicencio1,2 - https//orcid.org/000-0002-5223-1017
Héctor Eduardo Cepeda Inca1,2 - https//orcid.org/0000-0003-0567-6096
Universidad Central del Ecuador, Quito-Ecuador.
Facultad de Odontología, Universidad de Sao Paulo, Sao Paulo-Brasil.
Autor de correspondencia: Héctor Eduardo Cepeda Inca, Facultad de Odontología, Universi-
dad Central del Ecuador, Avenida América, Quito Ecuador. Email: hecepeda@uce.edu.ec.
RESUMEN
Frecuentemente, se hayan especies del género Candida en la microbiota oral de los humanos.
Objetivo: comparar la efectividad antimicrobiana de la terapia fotodinámica sobre las cepas de
Candida albicans en superficies acrílicas para prótesis dentales, empleando láser con 660nm de
longitud de onda y azul de metileno como agente fotosensibilizador, con respecto a otros méto-
dos terapéuticos. Metodología: estudio in vitro, empleando 60 discos de acrílico de termocurado
sumergidos en una suspensión de C. albicans, generando una simulación de biofilm sobre la
superficie de una prótesis dental. Luego se conformaron cinco grupos al azar de 12 unidades a
los que se aplicó diferentes procedimientos terapéuticos: G1 (suero fisiológico), G2 (clorhexidi-
na al 0,12%), G3 (nistatina en solución tópica en 0,001ml/ul), G4 (azul de metileno al 0,005% +
-
tiva al comparar los grupos G4 y G5 con respecto a los G1 y G3 (p<0,05). Conclusión: la efica-
cia en la reducción del número de UFC viables de C. albicans resultó superior en los grupos
donde se empleó radiación láser con una longitud de onda de 660nm con diferentes concentra-
ciones de azul de metileno. El uso de nistatina y de suero fisiológico tuvieron los menores valo-
res de eficacia.
Palabras clave: fotoquimioterapia, terapia por láser, candidiasis bucal, prótesis dental.
ABSTRACT
Species of the genus Candida are frequently found in the oral microbiota of humans. Objective:
to compare the antimicrobial effectiveness of photodynamic therapy on Candida albicans
strains on acrylic surfaces for dental prostheses by using a 660nm wavelength laser and methyle-
ne blue as a photosensitizing agent, with respect to other therapeutic methods. Methodology: in
vitro study, using 60 thermosetting acrylic discs immersed in a suspension of C. albicans, gene-
rating a biofilm simulation on the surface of a dental prosthesis. After that, five random groups
of 12 units were formed to apply them different therapeutic procedures: G1 (saline solution), G2
(chlorhexidine 0.12%), G3 (nystatin in topical solution at 0.001ml/ul), G4 (0.005% methylene
observed when comparing groups G4 and G5 with respect to G1 and G3 (p<0.05). Conclusion:
the efficacy in reducing the number of viable C. albicans CFU was higher in the groups where
laser radiation with a wavelength of 660nm was used with different concentrations of methylene
blue. The use of nystatin and physiological saline had the lowest efficacy values.
Keywords: Photochemotherapy; Laser Therapy; Candidiasis, Oral; Dental Prosthesis.
INTRODUCCIÓN
Las especies del género Candida se hallan frecuentemente en la microbiota oral de los huma-
nos.(1) En la mayoría de los individuos, este microorganismo reside como un huésped inofensivo;
sin embargo, ante factores predisponentes, pueden causar infecciones que van desde lesiones
superficiales de la mucosa hasta procesos sistémicos que amenazan la vida.(2-4)
Candida albicans es un hongo dimórfico capaz de evadir los mecanismos de defensa del hués-
ped, permitiéndole colonizar el epitelio a través de la secreción de enzimas hidrolíticas tales
como: proteinasas y fosfolipasas; lo que produce metabolitos ácidos, otras sustancias tóxicas y
la transición fenotípica de blastosporas a hifas o pseudohifas.(1,5) Esa capacidad de adherencia
favorece el desarrollo de estomatitis por prótesis dental (EPD) que se puede agravar ante eleva-
do consumo de azúcar.(3)
El uso de prótesis dentales acrílicas se relaciona con infecciones por Candida albicans, princi-
palmente, si existe potencial contaminación por exceder la vida útil de la prótesis y una deficien-
te higiene oral.(1)
Este tipo de infección dificulta la alimentación debido a la presencia de sangrado y exudado,
acompañado de ardor, dolor, halitosis, gusto desagradable y sequedad bucal.(4)
El control de las infecciones por Candida albicans resulta difícil por su naturaleza multifacto-
rial.(4) El tratamiento más empleado se basa en la medicación mediante antifúngicos en diferen-
tes presentaciones: tabletas, enjuagues y antisépticos para la desinfección de la prótesis. Aunque,
se exploran otros tratamientos por el incremento de la resistencia microbiológica a los medica-
mentos de elección.(5,6)
La terapia fotodinámica (PDT, por sus siglas del inglés Photodynamic Therapy) constituye un
procedimiento terapéutico alternativo para la inactivación de microorganismos patógenos.(6,7)
Este consiste en la administración de un agente fotosensibilizante que se irradia con una longitud
de onda específica, produciéndose especies reactivas de oxígeno (ROS) que provocan la muerte
del hongo.(8,9)
Existen dos mecanimos para la producción de ROS:(10)
• Tipo I, mediante transferencia de electrones al O que produce: superóxido, peróxido de
hidrógeno e hidroxilo.
• Tipo II, a través de transferencia de energía que produce oxígeno singlete.
Al acumularse o atravesar la membrana citoplasmática, el agente fotosensibilizador provoca
daños irreversibles en las bacterias después de la irradiación. La efectividad de la PDT depende-
rá de la longitud de onda aplicada, la concentración el agente fotosensibilizador, el tiempo de
irradiación, la potencia de salida, el modo de irradiación (continuo o pulsado) y la convergencia
del haz de luz.(6,9)
Así, en el uso de PDT se emplea fuentes de luz roja (630nm-700nm) por la capacidad de las
longitudes de onda larga para penetrar efectivamente los tejidos biológicos, siendo preferible el
empleo de agentes fotosensibilizadores tales como: azul de metileno (AM), azul de toluidina
(AT) y el verde de malaquita (VM). Por otra parte, las fuentes de luz azul (380nm-520nm), utili-
zando como fotosensibilizadores: rosa de bengala (RB), eosina (EOS) y eritrosina (ERI).(9)
Considerando lo expuesto, la presente investigación tuvo el propósito de comparar la efectividad
antimicrobiana de la terapia fotodinámica sobre las cepas de C. albicans en superficies acrílicas
para prótesis dentales, empleando láser con 660nm de longitud de onda y azul de metileno como
agente fotosensibilizador, con respecto a otros métodos terapéuticos.
MATERIAL Y MÉTODOS
Se prepararon 60 discos de resina acrílica termopolimerizable de color rosado, el que se utiliza
habitualmente para la elaboración de prótesis dentales (MARCHE Termocurable, Santiago de
Chile) de 10 mm de diámetro y 3 mm de espesor, siguiendo las instrucciones del fabricante:
proporción de polvo/líquido 3.2:1 v/v). Este procedimiento se realizó siguiendo la técnica de
moldeo por compresión termopolimerizada, a partir de patrones de cera para modelar (Cera
Reus S.A Spain) con las mismas dimensiones, siendo enmuflados con yeso ISO tipo 3 (Rapid-
proceso térmico fue a 70ºC durante 90 minutos y luego a 100ºC por 30 minutos, para dejarse
enfriar durante 30 minutos. Cada muestra se pulió con papel de lija 600 para simular una superfi-
cie rugosa y se verificó las dimensiones de los discos mediante un paquímetro digital (TOTAL,
China). Finalmente, las muestras se esterilizaron en autoclave a 121ºC por 15 minutos.
Activación de las cepas
La activación de las cepas de Candida albicans se realizó en una cámara de flujo laminar
líquido de tripticasa soya; se dejó cultivar en una estufa (THELCO Thermo Electron Corpora-
tion USA) a 37°C por 48 horas y se evaluó el crecimiento por medición de la turbidez de 0,5 en
la escala de Mc Farland, equivalente a 1x108 unidades formadoras de colonias por mililitro.
Conformación de los grupos
El microorganismo activado se inoculó en los discos de acrílico colocando 2ml de caldo de culti-
vo en pocillos individuales y se llevó a incubación en una estufa (THELCO Thermo Electron
Corporation USA) a 37°C por 48 horas. Después del tiempo de incubación, cada uno de los
discos fueron colocados en pocillos individuales de cajas de cultivo estériles según los grupos
grupos en los que se aplicó 2 ml de cada sustancia estudiada durante 5 minutos: G1 suero fisioló-
gico, G2 clorhexidina al 0,12%, G3 Nistatina al 0,001 ml/ul, mientras que, en G4 y G5 se colocó
azul de metileno al 0,005% y 0,01%, respectivamente. Posterior, se eliminaron los excesos de
colorante y se irradiaron las superficies rugosas con un láser el diodo Therapy XT (DMC, São
90s, área del spot 0,028cm2 y una dosis de energía de 321J/cm2 a 1mm de distancia de forma
perpendicular en modo continuo.
Para garantizar que la energía sea constante en cada grupo, se verificó la potencia del láser
mediante un radiómetro (DMC, São Carlos/SP, Brazil) antes de realizar cada aplicación.
Siembra de los cultivos
A continuación, se hisopó la parte rugosa de cada disco, procediendo a inocular en medio de
cultivo Sabouraud a 37°C por 48 horas.
Las cepas de Candida albicans se cultivan con mayor rapidez en medios artificiales; así, durante
las primeras 24 horas ya se puedo observar colonias de aspecto cremoso, brillante y de color
blanco y entre las 48 y 72 horas se obtiene un nivel muy alto de desarrollo. Aun sin la presencia
de oxígeno, la incubación puede realizarse de 25 a 37°C con un nivel de riesgo de debilitar su
crecimiento.(11)
Conteo de las unidades formadoras de colonias (UFC)
Transcurridas 48 horas, se realizó el conteo de las UFC de cada una de las muestras para verifi-
car el nivel de crecimiento del microorganismo por cuadrantes, utilizando un contador de colo-
nias de campo oscuro con iluminación uniforme de las placas con un aumento de 3x (QUEBEC
Darfield Colony Counter 220V/50Hz Reichert Technologies EE.UU.) (figura 1). Los datos
relativos a estas se agruparon en cuatro rangos de escala para su mejor procesamiento según
grupos experimentales: 0 a 99, 100 a 199, 200 a 300 y mayor que 300.
Figura 1. Variación de resultados en el conteo de los diferentes grupos: 1A (suero fisiológico),
1B (clorhexidina), 1C (nistatina 0,001 ml/ul), 1D (AM 0,005%) 1E (AM 0,01%)
Los datos recolectados fueron organizados en una base elaborada en el programa Microsoft
Excel para su posterior procesamiento y análisis, mediante estadísticas descriptivas de frecuen-
Los investigadores siguieron los principios de la investigación científica, cumpliendo con las
medidas de seguridad para el trabajo en el laboratorio de microbiología y la obtención de los
correspondientes permisos. El estudio contó con el aval de la carrera de Odontología de la
Universidad Central del Ecuador.
RESULTADOS
El proceso investigativo posibilitó comparar la efectividad de diversos métodos terapéuticos de
desinfección de superficies acrílicas de prótesis dentales contaminadas por Candida albicans.
Tabla 1
*Diferencias estadísticamente significativas
Los resultados obtenidos mostraron que entre ambos grupos donde se aplicó la terapia fotodiná-
mica (G4 y G5) no existió diferencias significativas, contrariamente a los observado al comparar
los datos de estos con respecto a los grupos en los que se aplicó suero fisiológico y nistatina (G1
y G3, respectivamente), con valores (p<0,05) (tabla 1).
Figura 2. Comparación de los grupos atendiendo a rangos de los valores de UFC
Las muestras presentaron un mayor crecimiento de Cándida albicans fueron en las que se utilizó
suero fisiológico (G1) y nistatina (G3), con un 100% de los valores en el rango de > 300 ufc,
observándose la mejor efectividad en los grupos donde se aplicó la terapia fotodinámica (G4 y
G5).
DISCUSIÓN
En otras investigaciones(12,13) también se reportó adecuados niveles de eficacia de la PDT con el
uso de AM como agente fotosensibilizador en infecciones bacterianas y fúngicas en afectaciones
dermatológicas, gástricas y de la cavidad oral. Aunque, debe destacarse que los reportes publica-
dos mencionan que ni el agente fotosensibilizante ni la irradiación por sí solos tienen un efecto
antimicrobiano significativo en cepas de C. albicans.(10,13,14)
En la PDT, las ROS (anión superóxido, radical hidroxilo, peróxido de hidrogeno y especialmen-
te el oxígeno singleto) son las que generan el estrés oxidativo. Estas alteran la integridad celular,
dañando el ADN, los lípidos, las proteinas y otras macromoléculas, lo que causa la muerte por
necrosis o apotosis. Además, cuando son endógenas propician una transición alcalina del ADN,
provocando daños en las purinas y/o pirimidinas y roturas dobles o sencillas en las cadenas de
nucleótidos con un efecto tóxico y mutagénico sobre las células de C. albicans.(15,16)
La dosificación del fotosensibilizador constituye un factor determinante en la eficacia de la
PDT.(17) Esta se realiza atendiendo a sensibilidad y concentración, considerando los parámetros
de irradiación con luz y concentración de oxígeno molecular disponible.(14,17,18)
Este estudio, la irradiación con láser y AM como fotosensibilizador fue el método más eficaz en
la reducción de UFC de C. albicans, empleando longitudes de onda de 660nm tal como reco-
mienda Nuñez.(17)
Pupo(14) señala que el número de UFC de C. albicans iniciales puede reducirse hasta en un
(18) hallaron una
disminución del 42%, mientras que Sousa et al.(13) reportaron un 88,6%; además de otros auto-
res(16,19) que informan el efecto fungicida significativo de este método en C. albicans.
Pasyechnikova et al.(20) considera que una mayor concentración del agente fotosensibilizador
pudiera generar agregados, alterando su banda de absorción, lo que se ha sido descrito con
sustancias como el AM y el azul de toluidina (AT); Aunque, otro criterio indica que concentra-
ciones elevadas pueden crear una barrera que impediría la difusión adecuada de la luz.(17)
Con respecto al uso de nistatina como antifúngico en infecciones cutáneas y de la mucosa origi-
nadas por Candida albicans, esta actúa uniéndose a los esteroles de su membrana celular, afec-
tando su permeabilidad, lo que provoca la eliminación de elementos intracelulares vitales.(15,21)
Así, contrariamente a los resultados obtenidos en la presente investigación, Bakhtiari et al.(22)
La clorhexidina es un detergente catiónico soluble en agua que reacciona con los lipopolisacari-
dos y fosfolipidos de la membrana celular, inhibiendo la utilización de oxígeno y causando la
muerte celular.(21) Los hallazgos del presente estudio mostraron la efectividad de esta sustancia
fue superior a la nistatina para disminuir la viabilidad de las UFC de C. albicans.
CONCLUSIONES
En ambos grupos donde se empleó la terapia fotodinámica con diferentes concentraciones de
azul de metileno y la radiación láser con una longitud de onda de 660nm, la eficacia en la reduc-
ción del número de UFC viables de C. albicans sobre superficies acrílicas fue superior al uso de
otros métodos mediante la aplicación de sustancias antifúngicas. Los grupos uno (suero fisioló-
gico) y tres (nistatina) constituyeron los métodos con menores valores de eficacia al respecto.
Agradecimientos: a los funcionarios del laboratorio de microbiología de la Facultad de la
Bioquímica de la Universidad Central del Ecuador por su valioso aporte en esta investigación.
Conflicto de intereses: los autores declaran que no existe.
Declaración de contribución: existió una participación homogénea y activa en la investiga-
ción, recolección de información científica actualizada y la redacción del artículo.
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Recibido: 19 de enero de 2022
Aprobado: 24 de marzo de 2022
REE Volumen 16(3) Riobamba sep. - dic. 2022
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
ISSN-impreso 1390-7581
ISSN-digital 2661-6742
Terapia fotodinámica antimicrobiana sobre Candida albicans en superficies acrílicas de
prótesis dentales. Estudio in vitro
Antimicrobial photodynamic therapy on Candida albicans on acrylic surfaces of dental
prostheses. In vitro study
https://doi.org/10.37135/ee.04.15.08
Autores:
María Alejandra Jarrín Ríos - https//orcid.org/0000-0002-6358-9962
Maria Fernanda Caicedo Breeddy - https//orcid.org/0000-0002-3118-196
Pablo Ruben Garrido Villavicencio1,2 - https//orcid.org/000-0002-5223-1017
Héctor Eduardo Cepeda Inca1,2 - https//orcid.org/0000-0003-0567-6096
Universidad Central del Ecuador, Quito-Ecuador.
Facultad de Odontología, Universidad de Sao Paulo, Sao Paulo-Brasil.
Autor de correspondencia: Héctor Eduardo Cepeda Inca, Facultad de Odontología, Universi-
dad Central del Ecuador, Avenida América, Quito Ecuador. Email: hecepeda@uce.edu.ec.
RESUMEN
Frecuentemente, se hayan especies del género Candida en la microbiota oral de los humanos.
Objetivo: comparar la efectividad antimicrobiana de la terapia fotodinámica sobre las cepas de
Candida albicans en superficies acrílicas para prótesis dentales, empleando láser con 660nm de
longitud de onda y azul de metileno como agente fotosensibilizador, con respecto a otros méto-
dos terapéuticos. Metodología: estudio in vitro, empleando 60 discos de acrílico de termocurado
sumergidos en una suspensión de C. albicans, generando una simulación de biofilm sobre la
superficie de una prótesis dental. Luego se conformaron cinco grupos al azar de 12 unidades a
los que se aplicó diferentes procedimientos terapéuticos: G1 (suero fisiológico), G2 (clorhexidi-
na al 0,12%), G3 (nistatina en solución tópica en 0,001ml/ul), G4 (azul de metileno al 0,005% +
-
tiva al comparar los grupos G4 y G5 con respecto a los G1 y G3 (p<0,05). Conclusión: la efica-
cia en la reducción del número de UFC viables de C. albicans resultó superior en los grupos
donde se empleó radiación láser con una longitud de onda de 660nm con diferentes concentra-
ciones de azul de metileno. El uso de nistatina y de suero fisiológico tuvieron los menores valo-
res de eficacia.
Palabras clave: fotoquimioterapia, terapia por láser, candidiasis bucal, prótesis dental.
ABSTRACT
Species of the genus Candida are frequently found in the oral microbiota of humans. Objective:
to compare the antimicrobial effectiveness of photodynamic therapy on Candida albicans
strains on acrylic surfaces for dental prostheses by using a 660nm wavelength laser and methyle-
ne blue as a photosensitizing agent, with respect to other therapeutic methods. Methodology: in
vitro study, using 60 thermosetting acrylic discs immersed in a suspension of C. albicans, gene-
rating a biofilm simulation on the surface of a dental prosthesis. After that, five random groups
of 12 units were formed to apply them different therapeutic procedures: G1 (saline solution), G2
(chlorhexidine 0.12%), G3 (nystatin in topical solution at 0.001ml/ul), G4 (0.005% methylene
observed when comparing groups G4 and G5 with respect to G1 and G3 (p<0.05). Conclusion:
the efficacy in reducing the number of viable C. albicans CFU was higher in the groups where
laser radiation with a wavelength of 660nm was used with different concentrations of methylene
blue. The use of nystatin and physiological saline had the lowest efficacy values.
Keywords: Photochemotherapy; Laser Therapy; Candidiasis, Oral; Dental Prosthesis.
INTRODUCCIÓN
Las especies del género Candida se hallan frecuentemente en la microbiota oral de los huma-
nos.(1) En la mayoría de los individuos, este microorganismo reside como un huésped inofensivo;
sin embargo, ante factores predisponentes, pueden causar infecciones que van desde lesiones
superficiales de la mucosa hasta procesos sistémicos que amenazan la vida.(2-4)
Candida albicans es un hongo dimórfico capaz de evadir los mecanismos de defensa del hués-
ped, permitiéndole colonizar el epitelio a través de la secreción de enzimas hidrolíticas tales
como: proteinasas y fosfolipasas; lo que produce metabolitos ácidos, otras sustancias tóxicas y
la transición fenotípica de blastosporas a hifas o pseudohifas.(1,5) Esa capacidad de adherencia
favorece el desarrollo de estomatitis por prótesis dental (EPD) que se puede agravar ante eleva-
do consumo de azúcar.(3)
El uso de prótesis dentales acrílicas se relaciona con infecciones por Candida albicans, princi-
palmente, si existe potencial contaminación por exceder la vida útil de la prótesis y una deficien-
te higiene oral.(1)
Este tipo de infección dificulta la alimentación debido a la presencia de sangrado y exudado,
acompañado de ardor, dolor, halitosis, gusto desagradable y sequedad bucal.(4)
El control de las infecciones por Candida albicans resulta difícil por su naturaleza multifacto-
rial.(4) El tratamiento más empleado se basa en la medicación mediante antifúngicos en diferen-
tes presentaciones: tabletas, enjuagues y antisépticos para la desinfección de la prótesis. Aunque,
se exploran otros tratamientos por el incremento de la resistencia microbiológica a los medica-
mentos de elección.(5,6)
La terapia fotodinámica (PDT, por sus siglas del inglés Photodynamic Therapy) constituye un
procedimiento terapéutico alternativo para la inactivación de microorganismos patógenos.(6,7)
Este consiste en la administración de un agente fotosensibilizante que se irradia con una longitud
de onda específica, produciéndose especies reactivas de oxígeno (ROS) que provocan la muerte
del hongo.(8,9)
Existen dos mecanimos para la producción de ROS:(10)
• Tipo I, mediante transferencia de electrones al O que produce: superóxido, peróxido de
hidrógeno e hidroxilo.
• Tipo II, a través de transferencia de energía que produce oxígeno singlete.
Al acumularse o atravesar la membrana citoplasmática, el agente fotosensibilizador provoca
daños irreversibles en las bacterias después de la irradiación. La efectividad de la PDT depende-
rá de la longitud de onda aplicada, la concentración el agente fotosensibilizador, el tiempo de
irradiación, la potencia de salida, el modo de irradiación (continuo o pulsado) y la convergencia
del haz de luz.(6,9)
Así, en el uso de PDT se emplea fuentes de luz roja (630nm-700nm) por la capacidad de las
longitudes de onda larga para penetrar efectivamente los tejidos biológicos, siendo preferible el
empleo de agentes fotosensibilizadores tales como: azul de metileno (AM), azul de toluidina
(AT) y el verde de malaquita (VM). Por otra parte, las fuentes de luz azul (380nm-520nm), utili-
zando como fotosensibilizadores: rosa de bengala (RB), eosina (EOS) y eritrosina (ERI).(9)
Considerando lo expuesto, la presente investigación tuvo el propósito de comparar la efectividad
antimicrobiana de la terapia fotodinámica sobre las cepas de C. albicans en superficies acrílicas
para prótesis dentales, empleando láser con 660nm de longitud de onda y azul de metileno como
agente fotosensibilizador, con respecto a otros métodos terapéuticos.
MATERIAL Y MÉTODOS
Se prepararon 60 discos de resina acrílica termopolimerizable de color rosado, el que se utiliza
habitualmente para la elaboración de prótesis dentales (MARCHE Termocurable, Santiago de
Chile) de 10 mm de diámetro y 3 mm de espesor, siguiendo las instrucciones del fabricante:
proporción de polvo/líquido 3.2:1 v/v). Este procedimiento se realizó siguiendo la técnica de
moldeo por compresión termopolimerizada, a partir de patrones de cera para modelar (Cera
Reus S.A Spain) con las mismas dimensiones, siendo enmuflados con yeso ISO tipo 3 (Rapid-
proceso térmico fue a 70ºC durante 90 minutos y luego a 100ºC por 30 minutos, para dejarse
enfriar durante 30 minutos. Cada muestra se pulió con papel de lija 600 para simular una superfi-
cie rugosa y se verificó las dimensiones de los discos mediante un paquímetro digital (TOTAL,
China). Finalmente, las muestras se esterilizaron en autoclave a 121ºC por 15 minutos.
Activación de las cepas
La activación de las cepas de Candida albicans se realizó en una cámara de flujo laminar
líquido de tripticasa soya; se dejó cultivar en una estufa (THELCO Thermo Electron Corpora-
tion USA) a 37°C por 48 horas y se evaluó el crecimiento por medición de la turbidez de 0,5 en
la escala de Mc Farland, equivalente a 1x108 unidades formadoras de colonias por mililitro.
Conformación de los grupos
El microorganismo activado se inoculó en los discos de acrílico colocando 2ml de caldo de culti-
vo en pocillos individuales y se llevó a incubación en una estufa (THELCO Thermo Electron
Corporation USA) a 37°C por 48 horas. Después del tiempo de incubación, cada uno de los
discos fueron colocados en pocillos individuales de cajas de cultivo estériles según los grupos
grupos en los que se aplicó 2 ml de cada sustancia estudiada durante 5 minutos: G1 suero fisioló-
gico, G2 clorhexidina al 0,12%, G3 Nistatina al 0,001 ml/ul, mientras que, en G4 y G5 se colocó
azul de metileno al 0,005% y 0,01%, respectivamente. Posterior, se eliminaron los excesos de
colorante y se irradiaron las superficies rugosas con un láser el diodo Therapy XT (DMC, São
90s, área del spot 0,028cm2 y una dosis de energía de 321J/cm2 a 1mm de distancia de forma
perpendicular en modo continuo.
Para garantizar que la energía sea constante en cada grupo, se verificó la potencia del láser
mediante un radiómetro (DMC, São Carlos/SP, Brazil) antes de realizar cada aplicación.
Siembra de los cultivos
A continuación, se hisopó la parte rugosa de cada disco, procediendo a inocular en medio de
cultivo Sabouraud a 37°C por 48 horas.
Las cepas de Candida albicans se cultivan con mayor rapidez en medios artificiales; así, durante
las primeras 24 horas ya se puedo observar colonias de aspecto cremoso, brillante y de color
blanco y entre las 48 y 72 horas se obtiene un nivel muy alto de desarrollo. Aun sin la presencia
de oxígeno, la incubación puede realizarse de 25 a 37°C con un nivel de riesgo de debilitar su
crecimiento.(11)
Conteo de las unidades formadoras de colonias (UFC)
Transcurridas 48 horas, se realizó el conteo de las UFC de cada una de las muestras para verifi-
car el nivel de crecimiento del microorganismo por cuadrantes, utilizando un contador de colo-
nias de campo oscuro con iluminación uniforme de las placas con un aumento de 3x (QUEBEC
Darfield Colony Counter 220V/50Hz Reichert Technologies EE.UU.) (figura 1). Los datos
relativos a estas se agruparon en cuatro rangos de escala para su mejor procesamiento según
grupos experimentales: 0 a 99, 100 a 199, 200 a 300 y mayor que 300.
Figura 1. Variación de resultados en el conteo de los diferentes grupos: 1A (suero fisiológico),
1B (clorhexidina), 1C (nistatina 0,001 ml/ul), 1D (AM 0,005%) 1E (AM 0,01%)
Los datos recolectados fueron organizados en una base elaborada en el programa Microsoft
Excel para su posterior procesamiento y análisis, mediante estadísticas descriptivas de frecuen-
Los investigadores siguieron los principios de la investigación científica, cumpliendo con las
medidas de seguridad para el trabajo en el laboratorio de microbiología y la obtención de los
correspondientes permisos. El estudio contó con el aval de la carrera de Odontología de la
Universidad Central del Ecuador.
RESULTADOS
El proceso investigativo posibilitó comparar la efectividad de diversos métodos terapéuticos de
desinfección de superficies acrílicas de prótesis dentales contaminadas por Candida albicans.
Tabla 1
*Diferencias estadísticamente significativas
Los resultados obtenidos mostraron que entre ambos grupos donde se aplicó la terapia fotodiná-
mica (G4 y G5) no existió diferencias significativas, contrariamente a los observado al comparar
los datos de estos con respecto a los grupos en los que se aplicó suero fisiológico y nistatina (G1
y G3, respectivamente), con valores (p<0,05) (tabla 1).
Figura 2. Comparación de los grupos atendiendo a rangos de los valores de UFC
Las muestras presentaron un mayor crecimiento de Cándida albicans fueron en las que se utilizó
suero fisiológico (G1) y nistatina (G3), con un 100% de los valores en el rango de > 300 ufc,
observándose la mejor efectividad en los grupos donde se aplicó la terapia fotodinámica (G4 y
G5).
DISCUSIÓN
En otras investigaciones(12,13) también se reportó adecuados niveles de eficacia de la PDT con el
uso de AM como agente fotosensibilizador en infecciones bacterianas y fúngicas en afectaciones
dermatológicas, gástricas y de la cavidad oral. Aunque, debe destacarse que los reportes publica-
dos mencionan que ni el agente fotosensibilizante ni la irradiación por sí solos tienen un efecto
antimicrobiano significativo en cepas de C. albicans.(10,13,14)
En la PDT, las ROS (anión superóxido, radical hidroxilo, peróxido de hidrogeno y especialmen-
te el oxígeno singleto) son las que generan el estrés oxidativo. Estas alteran la integridad celular,
dañando el ADN, los lípidos, las proteinas y otras macromoléculas, lo que causa la muerte por
necrosis o apotosis. Además, cuando son endógenas propician una transición alcalina del ADN,
provocando daños en las purinas y/o pirimidinas y roturas dobles o sencillas en las cadenas de
nucleótidos con un efecto tóxico y mutagénico sobre las células de C. albicans.(15,16)
La dosificación del fotosensibilizador constituye un factor determinante en la eficacia de la
PDT.(17) Esta se realiza atendiendo a sensibilidad y concentración, considerando los parámetros
de irradiación con luz y concentración de oxígeno molecular disponible.(14,17,18)
Este estudio, la irradiación con láser y AM como fotosensibilizador fue el método más eficaz en
la reducción de UFC de C. albicans, empleando longitudes de onda de 660nm tal como reco-
mienda Nuñez.(17)
Pupo(14) señala que el número de UFC de C. albicans iniciales puede reducirse hasta en un
(18) hallaron una
disminución del 42%, mientras que Sousa et al.(13) reportaron un 88,6%; además de otros auto-
res(16,19) que informan el efecto fungicida significativo de este método en C. albicans.
Pasyechnikova et al.(20) considera que una mayor concentración del agente fotosensibilizador
pudiera generar agregados, alterando su banda de absorción, lo que se ha sido descrito con
sustancias como el AM y el azul de toluidina (AT); Aunque, otro criterio indica que concentra-
ciones elevadas pueden crear una barrera que impediría la difusión adecuada de la luz.(17)
Con respecto al uso de nistatina como antifúngico en infecciones cutáneas y de la mucosa origi-
nadas por Candida albicans, esta actúa uniéndose a los esteroles de su membrana celular, afec-
tando su permeabilidad, lo que provoca la eliminación de elementos intracelulares vitales.(15,21)
Así, contrariamente a los resultados obtenidos en la presente investigación, Bakhtiari et al.(22)
La clorhexidina es un detergente catiónico soluble en agua que reacciona con los lipopolisacari-
dos y fosfolipidos de la membrana celular, inhibiendo la utilización de oxígeno y causando la
muerte celular.(21) Los hallazgos del presente estudio mostraron la efectividad de esta sustancia
fue superior a la nistatina para disminuir la viabilidad de las UFC de C. albicans.
CONCLUSIONES
En ambos grupos donde se empleó la terapia fotodinámica con diferentes concentraciones de
azul de metileno y la radiación láser con una longitud de onda de 660nm, la eficacia en la reduc-
ción del número de UFC viables de C. albicans sobre superficies acrílicas fue superior al uso de
otros métodos mediante la aplicación de sustancias antifúngicas. Los grupos uno (suero fisioló-
gico) y tres (nistatina) constituyeron los métodos con menores valores de eficacia al respecto.
Agradecimientos: a los funcionarios del laboratorio de microbiología de la Facultad de la
Bioquímica de la Universidad Central del Ecuador por su valioso aporte en esta investigación.
Conflicto de intereses: los autores declaran que no existe.
Declaración de contribución: existió una participación homogénea y activa en la investiga-
ción, recolección de información científica actualizada y la redacción del artículo.
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Recibido: 19 de enero de 2022
Aprobado: 24 de marzo de 2022
REE Volumen 16(3) Riobamba sep. - dic. 2022
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
ISSN-impreso 1390-7581
ISSN-digital 2661-6742
Terapia fotodinámica antimicrobiana sobre Candida albicans en superficies acrílicas de
prótesis dentales. Estudio in vitro
Antimicrobial photodynamic therapy on Candida albicans on acrylic surfaces of dental
prostheses. In vitro study
https://doi.org/10.37135/ee.04.15.08
Autores:
María Alejandra Jarrín Ríos - https//orcid.org/0000-0002-6358-9962
Maria Fernanda Caicedo Breeddy - https//orcid.org/0000-0002-3118-196
Pablo Ruben Garrido Villavicencio1,2 - https//orcid.org/000-0002-5223-1017
Héctor Eduardo Cepeda Inca1,2 - https//orcid.org/0000-0003-0567-6096
Universidad Central del Ecuador, Quito-Ecuador.
Facultad de Odontología, Universidad de Sao Paulo, Sao Paulo-Brasil.
Autor de correspondencia: Héctor Eduardo Cepeda Inca, Facultad de Odontología, Universi-
dad Central del Ecuador, Avenida América, Quito Ecuador. Email: hecepeda@uce.edu.ec.
RESUMEN
Frecuentemente, se hayan especies del género Candida en la microbiota oral de los humanos.
Objetivo: comparar la efectividad antimicrobiana de la terapia fotodinámica sobre las cepas de
Candida albicans en superficies acrílicas para prótesis dentales, empleando láser con 660nm de
longitud de onda y azul de metileno como agente fotosensibilizador, con respecto a otros méto-
dos terapéuticos. Metodología: estudio in vitro, empleando 60 discos de acrílico de termocurado
sumergidos en una suspensión de C. albicans, generando una simulación de biofilm sobre la
superficie de una prótesis dental. Luego se conformaron cinco grupos al azar de 12 unidades a
los que se aplicó diferentes procedimientos terapéuticos: G1 (suero fisiológico), G2 (clorhexidi-
na al 0,12%), G3 (nistatina en solución tópica en 0,001ml/ul), G4 (azul de metileno al 0,005% +
-
tiva al comparar los grupos G4 y G5 con respecto a los G1 y G3 (p<0,05). Conclusión: la efica-
cia en la reducción del número de UFC viables de C. albicans resultó superior en los grupos
donde se empleó radiación láser con una longitud de onda de 660nm con diferentes concentra-
ciones de azul de metileno. El uso de nistatina y de suero fisiológico tuvieron los menores valo-
res de eficacia.
Palabras clave: fotoquimioterapia, terapia por láser, candidiasis bucal, prótesis dental.
ABSTRACT
Species of the genus Candida are frequently found in the oral microbiota of humans. Objective:
to compare the antimicrobial effectiveness of photodynamic therapy on Candida albicans
strains on acrylic surfaces for dental prostheses by using a 660nm wavelength laser and methyle-
ne blue as a photosensitizing agent, with respect to other therapeutic methods. Methodology: in
vitro study, using 60 thermosetting acrylic discs immersed in a suspension of C. albicans, gene-
rating a biofilm simulation on the surface of a dental prosthesis. After that, five random groups
of 12 units were formed to apply them different therapeutic procedures: G1 (saline solution), G2
(chlorhexidine 0.12%), G3 (nystatin in topical solution at 0.001ml/ul), G4 (0.005% methylene
observed when comparing groups G4 and G5 with respect to G1 and G3 (p<0.05). Conclusion:
the efficacy in reducing the number of viable C. albicans CFU was higher in the groups where
laser radiation with a wavelength of 660nm was used with different concentrations of methylene
blue. The use of nystatin and physiological saline had the lowest efficacy values.
Keywords: Photochemotherapy; Laser Therapy; Candidiasis, Oral; Dental Prosthesis.
INTRODUCCIÓN
Las especies del género Candida se hallan frecuentemente en la microbiota oral de los huma-
nos.(1) En la mayoría de los individuos, este microorganismo reside como un huésped inofensivo;
sin embargo, ante factores predisponentes, pueden causar infecciones que van desde lesiones
superficiales de la mucosa hasta procesos sistémicos que amenazan la vida.(2-4)
Candida albicans es un hongo dimórfico capaz de evadir los mecanismos de defensa del hués-
ped, permitiéndole colonizar el epitelio a través de la secreción de enzimas hidrolíticas tales
como: proteinasas y fosfolipasas; lo que produce metabolitos ácidos, otras sustancias tóxicas y
la transición fenotípica de blastosporas a hifas o pseudohifas.(1,5) Esa capacidad de adherencia
favorece el desarrollo de estomatitis por prótesis dental (EPD) que se puede agravar ante eleva-
do consumo de azúcar.(3)
El uso de prótesis dentales acrílicas se relaciona con infecciones por Candida albicans, princi-
palmente, si existe potencial contaminación por exceder la vida útil de la prótesis y una deficien-
te higiene oral.(1)
Este tipo de infección dificulta la alimentación debido a la presencia de sangrado y exudado,
acompañado de ardor, dolor, halitosis, gusto desagradable y sequedad bucal.(4)
El control de las infecciones por Candida albicans resulta difícil por su naturaleza multifacto-
rial.(4) El tratamiento más empleado se basa en la medicación mediante antifúngicos en diferen-
tes presentaciones: tabletas, enjuagues y antisépticos para la desinfección de la prótesis. Aunque,
se exploran otros tratamientos por el incremento de la resistencia microbiológica a los medica-
mentos de elección.(5,6)
La terapia fotodinámica (PDT, por sus siglas del inglés Photodynamic Therapy) constituye un
procedimiento terapéutico alternativo para la inactivación de microorganismos patógenos.(6,7)
Este consiste en la administración de un agente fotosensibilizante que se irradia con una longitud
de onda específica, produciéndose especies reactivas de oxígeno (ROS) que provocan la muerte
del hongo.(8,9)
Existen dos mecanimos para la producción de ROS:(10)
• Tipo I, mediante transferencia de electrones al O que produce: superóxido, peróxido de
hidrógeno e hidroxilo.
• Tipo II, a través de transferencia de energía que produce oxígeno singlete.
Al acumularse o atravesar la membrana citoplasmática, el agente fotosensibilizador provoca
daños irreversibles en las bacterias después de la irradiación. La efectividad de la PDT depende-
rá de la longitud de onda aplicada, la concentración el agente fotosensibilizador, el tiempo de
irradiación, la potencia de salida, el modo de irradiación (continuo o pulsado) y la convergencia
del haz de luz.(6,9)
Así, en el uso de PDT se emplea fuentes de luz roja (630nm-700nm) por la capacidad de las
longitudes de onda larga para penetrar efectivamente los tejidos biológicos, siendo preferible el
empleo de agentes fotosensibilizadores tales como: azul de metileno (AM), azul de toluidina
(AT) y el verde de malaquita (VM). Por otra parte, las fuentes de luz azul (380nm-520nm), utili-
zando como fotosensibilizadores: rosa de bengala (RB), eosina (EOS) y eritrosina (ERI).(9)
Considerando lo expuesto, la presente investigación tuvo el propósito de comparar la efectividad
antimicrobiana de la terapia fotodinámica sobre las cepas de C. albicans en superficies acrílicas
para prótesis dentales, empleando láser con 660nm de longitud de onda y azul de metileno como
agente fotosensibilizador, con respecto a otros métodos terapéuticos.
MATERIAL Y MÉTODOS
Se prepararon 60 discos de resina acrílica termopolimerizable de color rosado, el que se utiliza
habitualmente para la elaboración de prótesis dentales (MARCHE Termocurable, Santiago de
Chile) de 10 mm de diámetro y 3 mm de espesor, siguiendo las instrucciones del fabricante:
proporción de polvo/líquido 3.2:1 v/v). Este procedimiento se realizó siguiendo la técnica de
moldeo por compresión termopolimerizada, a partir de patrones de cera para modelar (Cera
Reus S.A Spain) con las mismas dimensiones, siendo enmuflados con yeso ISO tipo 3 (Rapid-
proceso térmico fue a 70ºC durante 90 minutos y luego a 100ºC por 30 minutos, para dejarse
enfriar durante 30 minutos. Cada muestra se pulió con papel de lija 600 para simular una superfi-
cie rugosa y se verificó las dimensiones de los discos mediante un paquímetro digital (TOTAL,
China). Finalmente, las muestras se esterilizaron en autoclave a 121ºC por 15 minutos.
Activación de las cepas
La activación de las cepas de Candida albicans se realizó en una cámara de flujo laminar
líquido de tripticasa soya; se dejó cultivar en una estufa (THELCO Thermo Electron Corpora-
tion USA) a 37°C por 48 horas y se evaluó el crecimiento por medición de la turbidez de 0,5 en
la escala de Mc Farland, equivalente a 1x108 unidades formadoras de colonias por mililitro.
Conformación de los grupos
El microorganismo activado se inoculó en los discos de acrílico colocando 2ml de caldo de culti-
vo en pocillos individuales y se llevó a incubación en una estufa (THELCO Thermo Electron
Corporation USA) a 37°C por 48 horas. Después del tiempo de incubación, cada uno de los
discos fueron colocados en pocillos individuales de cajas de cultivo estériles según los grupos
grupos en los que se aplicó 2 ml de cada sustancia estudiada durante 5 minutos: G1 suero fisioló-
gico, G2 clorhexidina al 0,12%, G3 Nistatina al 0,001 ml/ul, mientras que, en G4 y G5 se colocó
azul de metileno al 0,005% y 0,01%, respectivamente. Posterior, se eliminaron los excesos de
colorante y se irradiaron las superficies rugosas con un láser el diodo Therapy XT (DMC, São
90s, área del spot 0,028cm2 y una dosis de energía de 321J/cm2 a 1mm de distancia de forma
perpendicular en modo continuo.
Para garantizar que la energía sea constante en cada grupo, se verificó la potencia del láser
mediante un radiómetro (DMC, São Carlos/SP, Brazil) antes de realizar cada aplicación.
Siembra de los cultivos
A continuación, se hisopó la parte rugosa de cada disco, procediendo a inocular en medio de
cultivo Sabouraud a 37°C por 48 horas.
Las cepas de Candida albicans se cultivan con mayor rapidez en medios artificiales; así, durante
las primeras 24 horas ya se puedo observar colonias de aspecto cremoso, brillante y de color
blanco y entre las 48 y 72 horas se obtiene un nivel muy alto de desarrollo. Aun sin la presencia
de oxígeno, la incubación puede realizarse de 25 a 37°C con un nivel de riesgo de debilitar su
crecimiento.(11)
Conteo de las unidades formadoras de colonias (UFC)
Transcurridas 48 horas, se realizó el conteo de las UFC de cada una de las muestras para verifi-
car el nivel de crecimiento del microorganismo por cuadrantes, utilizando un contador de colo-
nias de campo oscuro con iluminación uniforme de las placas con un aumento de 3x (QUEBEC
Darfield Colony Counter 220V/50Hz Reichert Technologies EE.UU.) (figura 1). Los datos
relativos a estas se agruparon en cuatro rangos de escala para su mejor procesamiento según
grupos experimentales: 0 a 99, 100 a 199, 200 a 300 y mayor que 300.
Figura 1. Variación de resultados en el conteo de los diferentes grupos: 1A (suero fisiológico),
1B (clorhexidina), 1C (nistatina 0,001 ml/ul), 1D (AM 0,005%) 1E (AM 0,01%)
Los datos recolectados fueron organizados en una base elaborada en el programa Microsoft
Excel para su posterior procesamiento y análisis, mediante estadísticas descriptivas de frecuen-
Los investigadores siguieron los principios de la investigación científica, cumpliendo con las
medidas de seguridad para el trabajo en el laboratorio de microbiología y la obtención de los
correspondientes permisos. El estudio contó con el aval de la carrera de Odontología de la
Universidad Central del Ecuador.
RESULTADOS
El proceso investigativo posibilitó comparar la efectividad de diversos métodos terapéuticos de
desinfección de superficies acrílicas de prótesis dentales contaminadas por Candida albicans.
Tabla 1
*Diferencias estadísticamente significativas
Los resultados obtenidos mostraron que entre ambos grupos donde se aplicó la terapia fotodiná-
mica (G4 y G5) no existió diferencias significativas, contrariamente a los observado al comparar
los datos de estos con respecto a los grupos en los que se aplicó suero fisiológico y nistatina (G1
y G3, respectivamente), con valores (p<0,05) (tabla 1).
Figura 2. Comparación de los grupos atendiendo a rangos de los valores de UFC
Las muestras presentaron un mayor crecimiento de Cándida albicans fueron en las que se utilizó
suero fisiológico (G1) y nistatina (G3), con un 100% de los valores en el rango de > 300 ufc,
observándose la mejor efectividad en los grupos donde se aplicó la terapia fotodinámica (G4 y
G5).
DISCUSIÓN
En otras investigaciones(12,13) también se reportó adecuados niveles de eficacia de la PDT con el
uso de AM como agente fotosensibilizador en infecciones bacterianas y fúngicas en afectaciones
dermatológicas, gástricas y de la cavidad oral. Aunque, debe destacarse que los reportes publica-
dos mencionan que ni el agente fotosensibilizante ni la irradiación por sí solos tienen un efecto
antimicrobiano significativo en cepas de C. albicans.(10,13,14)
En la PDT, las ROS (anión superóxido, radical hidroxilo, peróxido de hidrogeno y especialmen-
te el oxígeno singleto) son las que generan el estrés oxidativo. Estas alteran la integridad celular,
dañando el ADN, los lípidos, las proteinas y otras macromoléculas, lo que causa la muerte por
necrosis o apotosis. Además, cuando son endógenas propician una transición alcalina del ADN,
provocando daños en las purinas y/o pirimidinas y roturas dobles o sencillas en las cadenas de
nucleótidos con un efecto tóxico y mutagénico sobre las células de C. albicans.(15,16)
La dosificación del fotosensibilizador constituye un factor determinante en la eficacia de la
PDT.(17) Esta se realiza atendiendo a sensibilidad y concentración, considerando los parámetros
de irradiación con luz y concentración de oxígeno molecular disponible.(14,17,18)
Este estudio, la irradiación con láser y AM como fotosensibilizador fue el método más eficaz en
la reducción de UFC de C. albicans, empleando longitudes de onda de 660nm tal como reco-
mienda Nuñez.(17)
Pupo(14) señala que el número de UFC de C. albicans iniciales puede reducirse hasta en un
(18) hallaron una
disminución del 42%, mientras que Sousa et al.(13) reportaron un 88,6%; además de otros auto-
res(16,19) que informan el efecto fungicida significativo de este método en C. albicans.
Pasyechnikova et al.(20) considera que una mayor concentración del agente fotosensibilizador
pudiera generar agregados, alterando su banda de absorción, lo que se ha sido descrito con
sustancias como el AM y el azul de toluidina (AT); Aunque, otro criterio indica que concentra-
ciones elevadas pueden crear una barrera que impediría la difusión adecuada de la luz.(17)
Con respecto al uso de nistatina como antifúngico en infecciones cutáneas y de la mucosa origi-
nadas por Candida albicans, esta actúa uniéndose a los esteroles de su membrana celular, afec-
tando su permeabilidad, lo que provoca la eliminación de elementos intracelulares vitales.(15,21)
Así, contrariamente a los resultados obtenidos en la presente investigación, Bakhtiari et al.(22)
La clorhexidina es un detergente catiónico soluble en agua que reacciona con los lipopolisacari-
dos y fosfolipidos de la membrana celular, inhibiendo la utilización de oxígeno y causando la
muerte celular.(21) Los hallazgos del presente estudio mostraron la efectividad de esta sustancia
fue superior a la nistatina para disminuir la viabilidad de las UFC de C. albicans.
CONCLUSIONES
En ambos grupos donde se empleó la terapia fotodinámica con diferentes concentraciones de
azul de metileno y la radiación láser con una longitud de onda de 660nm, la eficacia en la reduc-
ción del número de UFC viables de C. albicans sobre superficies acrílicas fue superior al uso de
otros métodos mediante la aplicación de sustancias antifúngicas. Los grupos uno (suero fisioló-
gico) y tres (nistatina) constituyeron los métodos con menores valores de eficacia al respecto.
Agradecimientos: a los funcionarios del laboratorio de microbiología de la Facultad de la
Bioquímica de la Universidad Central del Ecuador por su valioso aporte en esta investigación.
Conflicto de intereses: los autores declaran que no existe.
Declaración de contribución: existió una participación homogénea y activa en la investiga-
ción, recolección de información científica actualizada y la redacción del artículo.
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Recibido: 19 de enero de 2022
Aprobado: 24 de marzo de 2022
Grupos p>(0,05)
Desviación
estándar
G4xG5
1,000
5,981
G4xG2
0,905
5,981
G4xG1
0,006*
5,981
G4xG3
0,006*
5,981
G5XG2
1,000
5,981
G5xG1
0,013*
5,981
G5xG3
0,013*
5,981
G2XG1
0,841
5,981
G2XG3
0,841
5,981
G1XG3
1,000
5,981
REE Volumen 16(3) Riobamba sep. - dic. 2022
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
ISSN-impreso 1390-7581
ISSN-digital 2661-6742
Terapia fotodinámica antimicrobiana sobre Candida albicans en superficies acrílicas de
prótesis dentales. Estudio in vitro
Antimicrobial photodynamic therapy on Candida albicans on acrylic surfaces of dental
prostheses. In vitro study
https://doi.org/10.37135/ee.04.15.08
Autores:
María Alejandra Jarrín Ríos - https//orcid.org/0000-0002-6358-9962
Maria Fernanda Caicedo Breeddy - https//orcid.org/0000-0002-3118-196
Pablo Ruben Garrido Villavicencio1,2 - https//orcid.org/000-0002-5223-1017
Héctor Eduardo Cepeda Inca1,2 - https//orcid.org/0000-0003-0567-6096
Universidad Central del Ecuador, Quito-Ecuador.
Facultad de Odontología, Universidad de Sao Paulo, Sao Paulo-Brasil.
Autor de correspondencia: Héctor Eduardo Cepeda Inca, Facultad de Odontología, Universi-
dad Central del Ecuador, Avenida América, Quito Ecuador. Email: hecepeda@uce.edu.ec.
RESUMEN
Frecuentemente, se hayan especies del género Candida en la microbiota oral de los humanos.
Objetivo: comparar la efectividad antimicrobiana de la terapia fotodinámica sobre las cepas de
Candida albicans en superficies acrílicas para prótesis dentales, empleando láser con 660nm de
longitud de onda y azul de metileno como agente fotosensibilizador, con respecto a otros méto-
dos terapéuticos. Metodología: estudio in vitro, empleando 60 discos de acrílico de termocurado
sumergidos en una suspensión de C. albicans, generando una simulación de biofilm sobre la
superficie de una prótesis dental. Luego se conformaron cinco grupos al azar de 12 unidades a
los que se aplicó diferentes procedimientos terapéuticos: G1 (suero fisiológico), G2 (clorhexidi-
na al 0,12%), G3 (nistatina en solución tópica en 0,001ml/ul), G4 (azul de metileno al 0,005% +
-
tiva al comparar los grupos G4 y G5 con respecto a los G1 y G3 (p<0,05). Conclusión: la efica-
cia en la reducción del número de UFC viables de C. albicans resultó superior en los grupos
donde se empleó radiación láser con una longitud de onda de 660nm con diferentes concentra-
ciones de azul de metileno. El uso de nistatina y de suero fisiológico tuvieron los menores valo-
res de eficacia.
Palabras clave: fotoquimioterapia, terapia por láser, candidiasis bucal, prótesis dental.
ABSTRACT
Species of the genus Candida are frequently found in the oral microbiota of humans. Objective:
to compare the antimicrobial effectiveness of photodynamic therapy on Candida albicans
strains on acrylic surfaces for dental prostheses by using a 660nm wavelength laser and methyle-
ne blue as a photosensitizing agent, with respect to other therapeutic methods. Methodology: in
vitro study, using 60 thermosetting acrylic discs immersed in a suspension of C. albicans, gene-
rating a biofilm simulation on the surface of a dental prosthesis. After that, five random groups
of 12 units were formed to apply them different therapeutic procedures: G1 (saline solution), G2
(chlorhexidine 0.12%), G3 (nystatin in topical solution at 0.001ml/ul), G4 (0.005% methylene
observed when comparing groups G4 and G5 with respect to G1 and G3 (p<0.05). Conclusion:
the efficacy in reducing the number of viable C. albicans CFU was higher in the groups where
laser radiation with a wavelength of 660nm was used with different concentrations of methylene
blue. The use of nystatin and physiological saline had the lowest efficacy values.
Keywords: Photochemotherapy; Laser Therapy; Candidiasis, Oral; Dental Prosthesis.
INTRODUCCIÓN
Las especies del género Candida se hallan frecuentemente en la microbiota oral de los huma-
nos.(1) En la mayoría de los individuos, este microorganismo reside como un huésped inofensivo;
sin embargo, ante factores predisponentes, pueden causar infecciones que van desde lesiones
superficiales de la mucosa hasta procesos sistémicos que amenazan la vida.(2-4)
Candida albicans es un hongo dimórfico capaz de evadir los mecanismos de defensa del hués-
ped, permitiéndole colonizar el epitelio a través de la secreción de enzimas hidrolíticas tales
como: proteinasas y fosfolipasas; lo que produce metabolitos ácidos, otras sustancias tóxicas y
la transición fenotípica de blastosporas a hifas o pseudohifas.(1,5) Esa capacidad de adherencia
favorece el desarrollo de estomatitis por prótesis dental (EPD) que se puede agravar ante eleva-
do consumo de azúcar.(3)
El uso de prótesis dentales acrílicas se relaciona con infecciones por Candida albicans, princi-
palmente, si existe potencial contaminación por exceder la vida útil de la prótesis y una deficien-
te higiene oral.(1)
Este tipo de infección dificulta la alimentación debido a la presencia de sangrado y exudado,
acompañado de ardor, dolor, halitosis, gusto desagradable y sequedad bucal.(4)
El control de las infecciones por Candida albicans resulta difícil por su naturaleza multifacto-
rial.(4) El tratamiento más empleado se basa en la medicación mediante antifúngicos en diferen-
tes presentaciones: tabletas, enjuagues y antisépticos para la desinfección de la prótesis. Aunque,
se exploran otros tratamientos por el incremento de la resistencia microbiológica a los medica-
mentos de elección.(5,6)
La terapia fotodinámica (PDT, por sus siglas del inglés Photodynamic Therapy) constituye un
procedimiento terapéutico alternativo para la inactivación de microorganismos patógenos.(6,7)
Este consiste en la administración de un agente fotosensibilizante que se irradia con una longitud
de onda específica, produciéndose especies reactivas de oxígeno (ROS) que provocan la muerte
del hongo.(8,9)
Existen dos mecanimos para la producción de ROS:(10)
• Tipo I, mediante transferencia de electrones al O que produce: superóxido, peróxido de
hidrógeno e hidroxilo.
• Tipo II, a través de transferencia de energía que produce oxígeno singlete.
Al acumularse o atravesar la membrana citoplasmática, el agente fotosensibilizador provoca
daños irreversibles en las bacterias después de la irradiación. La efectividad de la PDT depende-
rá de la longitud de onda aplicada, la concentración el agente fotosensibilizador, el tiempo de
irradiación, la potencia de salida, el modo de irradiación (continuo o pulsado) y la convergencia
del haz de luz.(6,9)
Así, en el uso de PDT se emplea fuentes de luz roja (630nm-700nm) por la capacidad de las
longitudes de onda larga para penetrar efectivamente los tejidos biológicos, siendo preferible el
empleo de agentes fotosensibilizadores tales como: azul de metileno (AM), azul de toluidina
(AT) y el verde de malaquita (VM). Por otra parte, las fuentes de luz azul (380nm-520nm), utili-
zando como fotosensibilizadores: rosa de bengala (RB), eosina (EOS) y eritrosina (ERI).(9)
Considerando lo expuesto, la presente investigación tuvo el propósito de comparar la efectividad
antimicrobiana de la terapia fotodinámica sobre las cepas de C. albicans en superficies acrílicas
para prótesis dentales, empleando láser con 660nm de longitud de onda y azul de metileno como
agente fotosensibilizador, con respecto a otros métodos terapéuticos.
MATERIAL Y MÉTODOS
Se prepararon 60 discos de resina acrílica termopolimerizable de color rosado, el que se utiliza
habitualmente para la elaboración de prótesis dentales (MARCHE Termocurable, Santiago de
Chile) de 10 mm de diámetro y 3 mm de espesor, siguiendo las instrucciones del fabricante:
proporción de polvo/líquido 3.2:1 v/v). Este procedimiento se realizó siguiendo la técnica de
moldeo por compresión termopolimerizada, a partir de patrones de cera para modelar (Cera
Reus S.A Spain) con las mismas dimensiones, siendo enmuflados con yeso ISO tipo 3 (Rapid-
proceso térmico fue a 70ºC durante 90 minutos y luego a 100ºC por 30 minutos, para dejarse
enfriar durante 30 minutos. Cada muestra se pulió con papel de lija 600 para simular una superfi-
cie rugosa y se verificó las dimensiones de los discos mediante un paquímetro digital (TOTAL,
China). Finalmente, las muestras se esterilizaron en autoclave a 121ºC por 15 minutos.
Activación de las cepas
La activación de las cepas de Candida albicans se realizó en una cámara de flujo laminar
líquido de tripticasa soya; se dejó cultivar en una estufa (THELCO Thermo Electron Corpora-
tion USA) a 37°C por 48 horas y se evaluó el crecimiento por medición de la turbidez de 0,5 en
la escala de Mc Farland, equivalente a 1x108 unidades formadoras de colonias por mililitro.
Conformación de los grupos
El microorganismo activado se inoculó en los discos de acrílico colocando 2ml de caldo de culti-
vo en pocillos individuales y se llevó a incubación en una estufa (THELCO Thermo Electron
Corporation USA) a 37°C por 48 horas. Después del tiempo de incubación, cada uno de los
discos fueron colocados en pocillos individuales de cajas de cultivo estériles según los grupos
grupos en los que se aplicó 2 ml de cada sustancia estudiada durante 5 minutos: G1 suero fisioló-
gico, G2 clorhexidina al 0,12%, G3 Nistatina al 0,001 ml/ul, mientras que, en G4 y G5 se colocó
azul de metileno al 0,005% y 0,01%, respectivamente. Posterior, se eliminaron los excesos de
colorante y se irradiaron las superficies rugosas con un láser el diodo Therapy XT (DMC, São
90s, área del spot 0,028cm2 y una dosis de energía de 321J/cm2 a 1mm de distancia de forma
perpendicular en modo continuo.
Para garantizar que la energía sea constante en cada grupo, se verificó la potencia del láser
mediante un radiómetro (DMC, São Carlos/SP, Brazil) antes de realizar cada aplicación.
Siembra de los cultivos
A continuación, se hisopó la parte rugosa de cada disco, procediendo a inocular en medio de
cultivo Sabouraud a 37°C por 48 horas.
Las cepas de Candida albicans se cultivan con mayor rapidez en medios artificiales; así, durante
las primeras 24 horas ya se puedo observar colonias de aspecto cremoso, brillante y de color
blanco y entre las 48 y 72 horas se obtiene un nivel muy alto de desarrollo. Aun sin la presencia
de oxígeno, la incubación puede realizarse de 25 a 37°C con un nivel de riesgo de debilitar su
crecimiento.(11)
Conteo de las unidades formadoras de colonias (UFC)
Transcurridas 48 horas, se realizó el conteo de las UFC de cada una de las muestras para verifi-
car el nivel de crecimiento del microorganismo por cuadrantes, utilizando un contador de colo-
nias de campo oscuro con iluminación uniforme de las placas con un aumento de 3x (QUEBEC
Darfield Colony Counter 220V/50Hz Reichert Technologies EE.UU.) (figura 1). Los datos
relativos a estas se agruparon en cuatro rangos de escala para su mejor procesamiento según
grupos experimentales: 0 a 99, 100 a 199, 200 a 300 y mayor que 300.
Figura 1. Variación de resultados en el conteo de los diferentes grupos: 1A (suero fisiológico),
1B (clorhexidina), 1C (nistatina 0,001 ml/ul), 1D (AM 0,005%) 1E (AM 0,01%)
Los datos recolectados fueron organizados en una base elaborada en el programa Microsoft
Excel para su posterior procesamiento y análisis, mediante estadísticas descriptivas de frecuen-
Los investigadores siguieron los principios de la investigación científica, cumpliendo con las
medidas de seguridad para el trabajo en el laboratorio de microbiología y la obtención de los
correspondientes permisos. El estudio contó con el aval de la carrera de Odontología de la
Universidad Central del Ecuador.
RESULTADOS
El proceso investigativo posibilitó comparar la efectividad de diversos métodos terapéuticos de
desinfección de superficies acrílicas de prótesis dentales contaminadas por Candida albicans.
Tabla 1
*Diferencias estadísticamente significativas
Los resultados obtenidos mostraron que entre ambos grupos donde se aplicó la terapia fotodiná-
mica (G4 y G5) no existió diferencias significativas, contrariamente a los observado al comparar
los datos de estos con respecto a los grupos en los que se aplicó suero fisiológico y nistatina (G1
y G3, respectivamente), con valores (p<0,05) (tabla 1).
Figura 2. Comparación de los grupos atendiendo a rangos de los valores de UFC
Las muestras presentaron un mayor crecimiento de Cándida albicans fueron en las que se utilizó
suero fisiológico (G1) y nistatina (G3), con un 100% de los valores en el rango de > 300 ufc,
observándose la mejor efectividad en los grupos donde se aplicó la terapia fotodinámica (G4 y
G5).
DISCUSIÓN
En otras investigaciones(12,13) también se reportó adecuados niveles de eficacia de la PDT con el
uso de AM como agente fotosensibilizador en infecciones bacterianas y fúngicas en afectaciones
dermatológicas, gástricas y de la cavidad oral. Aunque, debe destacarse que los reportes publica-
dos mencionan que ni el agente fotosensibilizante ni la irradiación por sí solos tienen un efecto
antimicrobiano significativo en cepas de C. albicans.(10,13,14)
En la PDT, las ROS (anión superóxido, radical hidroxilo, peróxido de hidrogeno y especialmen-
te el oxígeno singleto) son las que generan el estrés oxidativo. Estas alteran la integridad celular,
dañando el ADN, los lípidos, las proteinas y otras macromoléculas, lo que causa la muerte por
necrosis o apotosis. Además, cuando son endógenas propician una transición alcalina del ADN,
provocando daños en las purinas y/o pirimidinas y roturas dobles o sencillas en las cadenas de
nucleótidos con un efecto tóxico y mutagénico sobre las células de C. albicans.(15,16)
La dosificación del fotosensibilizador constituye un factor determinante en la eficacia de la
PDT.(17) Esta se realiza atendiendo a sensibilidad y concentración, considerando los parámetros
de irradiación con luz y concentración de oxígeno molecular disponible.(14,17,18)
Este estudio, la irradiación con láser y AM como fotosensibilizador fue el método más eficaz en
la reducción de UFC de C. albicans, empleando longitudes de onda de 660nm tal como reco-
mienda Nuñez.(17)
Pupo(14) señala que el número de UFC de C. albicans iniciales puede reducirse hasta en un
(18) hallaron una
disminución del 42%, mientras que Sousa et al.(13) reportaron un 88,6%; además de otros auto-
res(16,19) que informan el efecto fungicida significativo de este método en C. albicans.
Pasyechnikova et al.(20) considera que una mayor concentración del agente fotosensibilizador
pudiera generar agregados, alterando su banda de absorción, lo que se ha sido descrito con
sustancias como el AM y el azul de toluidina (AT); Aunque, otro criterio indica que concentra-
ciones elevadas pueden crear una barrera que impediría la difusión adecuada de la luz.(17)
Con respecto al uso de nistatina como antifúngico en infecciones cutáneas y de la mucosa origi-
nadas por Candida albicans, esta actúa uniéndose a los esteroles de su membrana celular, afec-
tando su permeabilidad, lo que provoca la eliminación de elementos intracelulares vitales.(15,21)
Así, contrariamente a los resultados obtenidos en la presente investigación, Bakhtiari et al.(22)
La clorhexidina es un detergente catiónico soluble en agua que reacciona con los lipopolisacari-
dos y fosfolipidos de la membrana celular, inhibiendo la utilización de oxígeno y causando la
muerte celular.(21) Los hallazgos del presente estudio mostraron la efectividad de esta sustancia
fue superior a la nistatina para disminuir la viabilidad de las UFC de C. albicans.
CONCLUSIONES
En ambos grupos donde se empleó la terapia fotodinámica con diferentes concentraciones de
azul de metileno y la radiación láser con una longitud de onda de 660nm, la eficacia en la reduc-
ción del número de UFC viables de C. albicans sobre superficies acrílicas fue superior al uso de
otros métodos mediante la aplicación de sustancias antifúngicas. Los grupos uno (suero fisioló-
gico) y tres (nistatina) constituyeron los métodos con menores valores de eficacia al respecto.
Agradecimientos: a los funcionarios del laboratorio de microbiología de la Facultad de la
Bioquímica de la Universidad Central del Ecuador por su valioso aporte en esta investigación.
Conflicto de intereses: los autores declaran que no existe.
Declaración de contribución: existió una participación homogénea y activa en la investiga-
ción, recolección de información científica actualizada y la redacción del artículo.
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Recibido: 19 de enero de 2022
Aprobado: 24 de marzo de 2022
REE Volumen 16(3) Riobamba sep. - dic. 2022
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
ISSN-impreso 1390-7581
ISSN-digital 2661-6742
Terapia fotodinámica antimicrobiana sobre Candida albicans en superficies acrílicas de
prótesis dentales. Estudio in vitro
Antimicrobial photodynamic therapy on Candida albicans on acrylic surfaces of dental
prostheses. In vitro study
https://doi.org/10.37135/ee.04.15.08
Autores:
María Alejandra Jarrín Ríos - https//orcid.org/0000-0002-6358-9962
Maria Fernanda Caicedo Breeddy - https//orcid.org/0000-0002-3118-196
Pablo Ruben Garrido Villavicencio1,2 - https//orcid.org/000-0002-5223-1017
Héctor Eduardo Cepeda Inca1,2 - https//orcid.org/0000-0003-0567-6096
Universidad Central del Ecuador, Quito-Ecuador.
Facultad de Odontología, Universidad de Sao Paulo, Sao Paulo-Brasil.
Autor de correspondencia: Héctor Eduardo Cepeda Inca, Facultad de Odontología, Universi-
dad Central del Ecuador, Avenida América, Quito Ecuador. Email: hecepeda@uce.edu.ec.
RESUMEN
Frecuentemente, se hayan especies del género Candida en la microbiota oral de los humanos.
Objetivo: comparar la efectividad antimicrobiana de la terapia fotodinámica sobre las cepas de
Candida albicans en superficies acrílicas para prótesis dentales, empleando láser con 660nm de
longitud de onda y azul de metileno como agente fotosensibilizador, con respecto a otros méto-
dos terapéuticos. Metodología: estudio in vitro, empleando 60 discos de acrílico de termocurado
sumergidos en una suspensión de C. albicans, generando una simulación de biofilm sobre la
superficie de una prótesis dental. Luego se conformaron cinco grupos al azar de 12 unidades a
los que se aplicó diferentes procedimientos terapéuticos: G1 (suero fisiológico), G2 (clorhexidi-
na al 0,12%), G3 (nistatina en solución tópica en 0,001ml/ul), G4 (azul de metileno al 0,005% +
-
tiva al comparar los grupos G4 y G5 con respecto a los G1 y G3 (p<0,05). Conclusión: la efica-
cia en la reducción del número de UFC viables de C. albicans resultó superior en los grupos
donde se empleó radiación láser con una longitud de onda de 660nm con diferentes concentra-
ciones de azul de metileno. El uso de nistatina y de suero fisiológico tuvieron los menores valo-
res de eficacia.
Palabras clave: fotoquimioterapia, terapia por láser, candidiasis bucal, prótesis dental.
ABSTRACT
Species of the genus Candida are frequently found in the oral microbiota of humans. Objective:
to compare the antimicrobial effectiveness of photodynamic therapy on Candida albicans
strains on acrylic surfaces for dental prostheses by using a 660nm wavelength laser and methyle-
ne blue as a photosensitizing agent, with respect to other therapeutic methods. Methodology: in
vitro study, using 60 thermosetting acrylic discs immersed in a suspension of C. albicans, gene-
rating a biofilm simulation on the surface of a dental prosthesis. After that, five random groups
of 12 units were formed to apply them different therapeutic procedures: G1 (saline solution), G2
(chlorhexidine 0.12%), G3 (nystatin in topical solution at 0.001ml/ul), G4 (0.005% methylene
observed when comparing groups G4 and G5 with respect to G1 and G3 (p<0.05). Conclusion:
the efficacy in reducing the number of viable C. albicans CFU was higher in the groups where
laser radiation with a wavelength of 660nm was used with different concentrations of methylene
blue. The use of nystatin and physiological saline had the lowest efficacy values.
Keywords: Photochemotherapy; Laser Therapy; Candidiasis, Oral; Dental Prosthesis.
INTRODUCCIÓN
Las especies del género Candida se hallan frecuentemente en la microbiota oral de los huma-
nos.(1) En la mayoría de los individuos, este microorganismo reside como un huésped inofensivo;
sin embargo, ante factores predisponentes, pueden causar infecciones que van desde lesiones
superficiales de la mucosa hasta procesos sistémicos que amenazan la vida.(2-4)
Candida albicans es un hongo dimórfico capaz de evadir los mecanismos de defensa del hués-
ped, permitiéndole colonizar el epitelio a través de la secreción de enzimas hidrolíticas tales
como: proteinasas y fosfolipasas; lo que produce metabolitos ácidos, otras sustancias tóxicas y
la transición fenotípica de blastosporas a hifas o pseudohifas.(1,5) Esa capacidad de adherencia
favorece el desarrollo de estomatitis por prótesis dental (EPD) que se puede agravar ante eleva-
do consumo de azúcar.(3)
El uso de prótesis dentales acrílicas se relaciona con infecciones por Candida albicans, princi-
palmente, si existe potencial contaminación por exceder la vida útil de la prótesis y una deficien-
te higiene oral.(1)
Este tipo de infección dificulta la alimentación debido a la presencia de sangrado y exudado,
acompañado de ardor, dolor, halitosis, gusto desagradable y sequedad bucal.(4)
El control de las infecciones por Candida albicans resulta difícil por su naturaleza multifacto-
rial.(4) El tratamiento más empleado se basa en la medicación mediante antifúngicos en diferen-
tes presentaciones: tabletas, enjuagues y antisépticos para la desinfección de la prótesis. Aunque,
se exploran otros tratamientos por el incremento de la resistencia microbiológica a los medica-
mentos de elección.(5,6)
La terapia fotodinámica (PDT, por sus siglas del inglés Photodynamic Therapy) constituye un
procedimiento terapéutico alternativo para la inactivación de microorganismos patógenos.(6,7)
Este consiste en la administración de un agente fotosensibilizante que se irradia con una longitud
de onda específica, produciéndose especies reactivas de oxígeno (ROS) que provocan la muerte
del hongo.(8,9)
Existen dos mecanimos para la producción de ROS:(10)
• Tipo I, mediante transferencia de electrones al O que produce: superóxido, peróxido de
hidrógeno e hidroxilo.
• Tipo II, a través de transferencia de energía que produce oxígeno singlete.
Al acumularse o atravesar la membrana citoplasmática, el agente fotosensibilizador provoca
daños irreversibles en las bacterias después de la irradiación. La efectividad de la PDT depende-
rá de la longitud de onda aplicada, la concentración el agente fotosensibilizador, el tiempo de
irradiación, la potencia de salida, el modo de irradiación (continuo o pulsado) y la convergencia
del haz de luz.(6,9)
Así, en el uso de PDT se emplea fuentes de luz roja (630nm-700nm) por la capacidad de las
longitudes de onda larga para penetrar efectivamente los tejidos biológicos, siendo preferible el
empleo de agentes fotosensibilizadores tales como: azul de metileno (AM), azul de toluidina
(AT) y el verde de malaquita (VM). Por otra parte, las fuentes de luz azul (380nm-520nm), utili-
zando como fotosensibilizadores: rosa de bengala (RB), eosina (EOS) y eritrosina (ERI).(9)
Considerando lo expuesto, la presente investigación tuvo el propósito de comparar la efectividad
antimicrobiana de la terapia fotodinámica sobre las cepas de C. albicans en superficies acrílicas
para prótesis dentales, empleando láser con 660nm de longitud de onda y azul de metileno como
agente fotosensibilizador, con respecto a otros métodos terapéuticos.
MATERIAL Y MÉTODOS
Se prepararon 60 discos de resina acrílica termopolimerizable de color rosado, el que se utiliza
habitualmente para la elaboración de prótesis dentales (MARCHE Termocurable, Santiago de
Chile) de 10 mm de diámetro y 3 mm de espesor, siguiendo las instrucciones del fabricante:
proporción de polvo/líquido 3.2:1 v/v). Este procedimiento se realizó siguiendo la técnica de
moldeo por compresión termopolimerizada, a partir de patrones de cera para modelar (Cera
Reus S.A Spain) con las mismas dimensiones, siendo enmuflados con yeso ISO tipo 3 (Rapid-
proceso térmico fue a 70ºC durante 90 minutos y luego a 100ºC por 30 minutos, para dejarse
enfriar durante 30 minutos. Cada muestra se pulió con papel de lija 600 para simular una superfi-
cie rugosa y se verificó las dimensiones de los discos mediante un paquímetro digital (TOTAL,
China). Finalmente, las muestras se esterilizaron en autoclave a 121ºC por 15 minutos.
Activación de las cepas
La activación de las cepas de Candida albicans se realizó en una cámara de flujo laminar
líquido de tripticasa soya; se dejó cultivar en una estufa (THELCO Thermo Electron Corpora-
tion USA) a 37°C por 48 horas y se evaluó el crecimiento por medición de la turbidez de 0,5 en
la escala de Mc Farland, equivalente a 1x108 unidades formadoras de colonias por mililitro.
Conformación de los grupos
El microorganismo activado se inoculó en los discos de acrílico colocando 2ml de caldo de culti-
vo en pocillos individuales y se llevó a incubación en una estufa (THELCO Thermo Electron
Corporation USA) a 37°C por 48 horas. Después del tiempo de incubación, cada uno de los
discos fueron colocados en pocillos individuales de cajas de cultivo estériles según los grupos
grupos en los que se aplicó 2 ml de cada sustancia estudiada durante 5 minutos: G1 suero fisioló-
gico, G2 clorhexidina al 0,12%, G3 Nistatina al 0,001 ml/ul, mientras que, en G4 y G5 se colocó
azul de metileno al 0,005% y 0,01%, respectivamente. Posterior, se eliminaron los excesos de
colorante y se irradiaron las superficies rugosas con un láser el diodo Therapy XT (DMC, São
90s, área del spot 0,028cm2 y una dosis de energía de 321J/cm2 a 1mm de distancia de forma
perpendicular en modo continuo.
Para garantizar que la energía sea constante en cada grupo, se verificó la potencia del láser
mediante un radiómetro (DMC, São Carlos/SP, Brazil) antes de realizar cada aplicación.
Siembra de los cultivos
A continuación, se hisopó la parte rugosa de cada disco, procediendo a inocular en medio de
cultivo Sabouraud a 37°C por 48 horas.
Las cepas de Candida albicans se cultivan con mayor rapidez en medios artificiales; así, durante
las primeras 24 horas ya se puedo observar colonias de aspecto cremoso, brillante y de color
blanco y entre las 48 y 72 horas se obtiene un nivel muy alto de desarrollo. Aun sin la presencia
de oxígeno, la incubación puede realizarse de 25 a 37°C con un nivel de riesgo de debilitar su
crecimiento.(11)
Conteo de las unidades formadoras de colonias (UFC)
Transcurridas 48 horas, se realizó el conteo de las UFC de cada una de las muestras para verifi-
car el nivel de crecimiento del microorganismo por cuadrantes, utilizando un contador de colo-
nias de campo oscuro con iluminación uniforme de las placas con un aumento de 3x (QUEBEC
Darfield Colony Counter 220V/50Hz Reichert Technologies EE.UU.) (figura 1). Los datos
relativos a estas se agruparon en cuatro rangos de escala para su mejor procesamiento según
grupos experimentales: 0 a 99, 100 a 199, 200 a 300 y mayor que 300.
Figura 1. Variación de resultados en el conteo de los diferentes grupos: 1A (suero fisiológico),
1B (clorhexidina), 1C (nistatina 0,001 ml/ul), 1D (AM 0,005%) 1E (AM 0,01%)
Los datos recolectados fueron organizados en una base elaborada en el programa Microsoft
Excel para su posterior procesamiento y análisis, mediante estadísticas descriptivas de frecuen-
Los investigadores siguieron los principios de la investigación científica, cumpliendo con las
medidas de seguridad para el trabajo en el laboratorio de microbiología y la obtención de los
correspondientes permisos. El estudio contó con el aval de la carrera de Odontología de la
Universidad Central del Ecuador.
RESULTADOS
El proceso investigativo posibilitó comparar la efectividad de diversos métodos terapéuticos de
desinfección de superficies acrílicas de prótesis dentales contaminadas por Candida albicans.
Tabla 1
*Diferencias estadísticamente significativas
Los resultados obtenidos mostraron que entre ambos grupos donde se aplicó la terapia fotodiná-
mica (G4 y G5) no existió diferencias significativas, contrariamente a los observado al comparar
los datos de estos con respecto a los grupos en los que se aplicó suero fisiológico y nistatina (G1
y G3, respectivamente), con valores (p<0,05) (tabla 1).
Figura 2. Comparación de los grupos atendiendo a rangos de los valores de UFC
Las muestras presentaron un mayor crecimiento de Cándida albicans fueron en las que se utilizó
suero fisiológico (G1) y nistatina (G3), con un 100% de los valores en el rango de > 300 ufc,
observándose la mejor efectividad en los grupos donde se aplicó la terapia fotodinámica (G4 y
G5).
DISCUSIÓN
En otras investigaciones(12,13) también se reportó adecuados niveles de eficacia de la PDT con el
uso de AM como agente fotosensibilizador en infecciones bacterianas y fúngicas en afectaciones
dermatológicas, gástricas y de la cavidad oral. Aunque, debe destacarse que los reportes publica-
dos mencionan que ni el agente fotosensibilizante ni la irradiación por sí solos tienen un efecto
antimicrobiano significativo en cepas de C. albicans.(10,13,14)
En la PDT, las ROS (anión superóxido, radical hidroxilo, peróxido de hidrogeno y especialmen-
te el oxígeno singleto) son las que generan el estrés oxidativo. Estas alteran la integridad celular,
dañando el ADN, los lípidos, las proteinas y otras macromoléculas, lo que causa la muerte por
necrosis o apotosis. Además, cuando son endógenas propician una transición alcalina del ADN,
provocando daños en las purinas y/o pirimidinas y roturas dobles o sencillas en las cadenas de
nucleótidos con un efecto tóxico y mutagénico sobre las células de C. albicans.(15,16)
La dosificación del fotosensibilizador constituye un factor determinante en la eficacia de la
PDT.(17) Esta se realiza atendiendo a sensibilidad y concentración, considerando los parámetros
de irradiación con luz y concentración de oxígeno molecular disponible.(14,17,18)
Este estudio, la irradiación con láser y AM como fotosensibilizador fue el método más eficaz en
la reducción de UFC de C. albicans, empleando longitudes de onda de 660nm tal como reco-
mienda Nuñez.(17)
Pupo(14) señala que el número de UFC de C. albicans iniciales puede reducirse hasta en un
(18) hallaron una
disminución del 42%, mientras que Sousa et al.(13) reportaron un 88,6%; además de otros auto-
res(16,19) que informan el efecto fungicida significativo de este método en C. albicans.
Pasyechnikova et al.(20) considera que una mayor concentración del agente fotosensibilizador
pudiera generar agregados, alterando su banda de absorción, lo que se ha sido descrito con
sustancias como el AM y el azul de toluidina (AT); Aunque, otro criterio indica que concentra-
ciones elevadas pueden crear una barrera que impediría la difusión adecuada de la luz.(17)
Con respecto al uso de nistatina como antifúngico en infecciones cutáneas y de la mucosa origi-
nadas por Candida albicans, esta actúa uniéndose a los esteroles de su membrana celular, afec-
tando su permeabilidad, lo que provoca la eliminación de elementos intracelulares vitales.(15,21)
Así, contrariamente a los resultados obtenidos en la presente investigación, Bakhtiari et al.(22)
La clorhexidina es un detergente catiónico soluble en agua que reacciona con los lipopolisacari-
dos y fosfolipidos de la membrana celular, inhibiendo la utilización de oxígeno y causando la
muerte celular.(21) Los hallazgos del presente estudio mostraron la efectividad de esta sustancia
fue superior a la nistatina para disminuir la viabilidad de las UFC de C. albicans.
CONCLUSIONES
En ambos grupos donde se empleó la terapia fotodinámica con diferentes concentraciones de
azul de metileno y la radiación láser con una longitud de onda de 660nm, la eficacia en la reduc-
ción del número de UFC viables de C. albicans sobre superficies acrílicas fue superior al uso de
otros métodos mediante la aplicación de sustancias antifúngicas. Los grupos uno (suero fisioló-
gico) y tres (nistatina) constituyeron los métodos con menores valores de eficacia al respecto.
Agradecimientos: a los funcionarios del laboratorio de microbiología de la Facultad de la
Bioquímica de la Universidad Central del Ecuador por su valioso aporte en esta investigación.
Conflicto de intereses: los autores declaran que no existe.
Declaración de contribución: existió una participación homogénea y activa en la investiga-
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Recibido: 19 de enero de 2022
Aprobado: 24 de marzo de 2022
REE Volumen 16(3) Riobamba sep. - dic. 2022
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
ISSN-impreso 1390-7581
ISSN-digital 2661-6742
Terapia fotodinámica antimicrobiana sobre Candida albicans en superficies acrílicas de
prótesis dentales. Estudio in vitro
Antimicrobial photodynamic therapy on Candida albicans on acrylic surfaces of dental
prostheses. In vitro study
https://doi.org/10.37135/ee.04.15.08
Autores:
María Alejandra Jarrín Ríos - https//orcid.org/0000-0002-6358-9962
Maria Fernanda Caicedo Breeddy - https//orcid.org/0000-0002-3118-196
Pablo Ruben Garrido Villavicencio1,2 - https//orcid.org/000-0002-5223-1017
Héctor Eduardo Cepeda Inca1,2 - https//orcid.org/0000-0003-0567-6096
Universidad Central del Ecuador, Quito-Ecuador.
Facultad de Odontología, Universidad de Sao Paulo, Sao Paulo-Brasil.
Autor de correspondencia: Héctor Eduardo Cepeda Inca, Facultad de Odontología, Universi-
dad Central del Ecuador, Avenida América, Quito Ecuador. Email: hecepeda@uce.edu.ec.
RESUMEN
Frecuentemente, se hayan especies del género Candida en la microbiota oral de los humanos.
Objetivo: comparar la efectividad antimicrobiana de la terapia fotodinámica sobre las cepas de
Candida albicans en superficies acrílicas para prótesis dentales, empleando láser con 660nm de
longitud de onda y azul de metileno como agente fotosensibilizador, con respecto a otros méto-
dos terapéuticos. Metodología: estudio in vitro, empleando 60 discos de acrílico de termocurado
sumergidos en una suspensión de C. albicans, generando una simulación de biofilm sobre la
superficie de una prótesis dental. Luego se conformaron cinco grupos al azar de 12 unidades a
los que se aplicó diferentes procedimientos terapéuticos: G1 (suero fisiológico), G2 (clorhexidi-
na al 0,12%), G3 (nistatina en solución tópica en 0,001ml/ul), G4 (azul de metileno al 0,005% +
-
tiva al comparar los grupos G4 y G5 con respecto a los G1 y G3 (p<0,05). Conclusión: la efica-
cia en la reducción del número de UFC viables de C. albicans resultó superior en los grupos
donde se empleó radiación láser con una longitud de onda de 660nm con diferentes concentra-
ciones de azul de metileno. El uso de nistatina y de suero fisiológico tuvieron los menores valo-
res de eficacia.
Palabras clave: fotoquimioterapia, terapia por láser, candidiasis bucal, prótesis dental.
ABSTRACT
Species of the genus Candida are frequently found in the oral microbiota of humans. Objective:
to compare the antimicrobial effectiveness of photodynamic therapy on Candida albicans
strains on acrylic surfaces for dental prostheses by using a 660nm wavelength laser and methyle-
ne blue as a photosensitizing agent, with respect to other therapeutic methods. Methodology: in
vitro study, using 60 thermosetting acrylic discs immersed in a suspension of C. albicans, gene-
rating a biofilm simulation on the surface of a dental prosthesis. After that, five random groups
of 12 units were formed to apply them different therapeutic procedures: G1 (saline solution), G2
(chlorhexidine 0.12%), G3 (nystatin in topical solution at 0.001ml/ul), G4 (0.005% methylene
observed when comparing groups G4 and G5 with respect to G1 and G3 (p<0.05). Conclusion:
the efficacy in reducing the number of viable C. albicans CFU was higher in the groups where
laser radiation with a wavelength of 660nm was used with different concentrations of methylene
blue. The use of nystatin and physiological saline had the lowest efficacy values.
Keywords: Photochemotherapy; Laser Therapy; Candidiasis, Oral; Dental Prosthesis.
INTRODUCCIÓN
Las especies del género Candida se hallan frecuentemente en la microbiota oral de los huma-
nos.(1) En la mayoría de los individuos, este microorganismo reside como un huésped inofensivo;
sin embargo, ante factores predisponentes, pueden causar infecciones que van desde lesiones
superficiales de la mucosa hasta procesos sistémicos que amenazan la vida.(2-4)
Candida albicans es un hongo dimórfico capaz de evadir los mecanismos de defensa del hués-
ped, permitiéndole colonizar el epitelio a través de la secreción de enzimas hidrolíticas tales
como: proteinasas y fosfolipasas; lo que produce metabolitos ácidos, otras sustancias tóxicas y
la transición fenotípica de blastosporas a hifas o pseudohifas.(1,5) Esa capacidad de adherencia
favorece el desarrollo de estomatitis por prótesis dental (EPD) que se puede agravar ante eleva-
do consumo de azúcar.(3)
El uso de prótesis dentales acrílicas se relaciona con infecciones por Candida albicans, princi-
palmente, si existe potencial contaminación por exceder la vida útil de la prótesis y una deficien-
te higiene oral.(1)
Este tipo de infección dificulta la alimentación debido a la presencia de sangrado y exudado,
acompañado de ardor, dolor, halitosis, gusto desagradable y sequedad bucal.(4)
El control de las infecciones por Candida albicans resulta difícil por su naturaleza multifacto-
rial.(4) El tratamiento más empleado se basa en la medicación mediante antifúngicos en diferen-
tes presentaciones: tabletas, enjuagues y antisépticos para la desinfección de la prótesis. Aunque,
se exploran otros tratamientos por el incremento de la resistencia microbiológica a los medica-
mentos de elección.(5,6)
La terapia fotodinámica (PDT, por sus siglas del inglés Photodynamic Therapy) constituye un
procedimiento terapéutico alternativo para la inactivación de microorganismos patógenos.(6,7)
Este consiste en la administración de un agente fotosensibilizante que se irradia con una longitud
de onda específica, produciéndose especies reactivas de oxígeno (ROS) que provocan la muerte
del hongo.(8,9)
Existen dos mecanimos para la producción de ROS:(10)
• Tipo I, mediante transferencia de electrones al O que produce: superóxido, peróxido de
hidrógeno e hidroxilo.
• Tipo II, a través de transferencia de energía que produce oxígeno singlete.
Al acumularse o atravesar la membrana citoplasmática, el agente fotosensibilizador provoca
daños irreversibles en las bacterias después de la irradiación. La efectividad de la PDT depende-
rá de la longitud de onda aplicada, la concentración el agente fotosensibilizador, el tiempo de
irradiación, la potencia de salida, el modo de irradiación (continuo o pulsado) y la convergencia
del haz de luz.(6,9)
Así, en el uso de PDT se emplea fuentes de luz roja (630nm-700nm) por la capacidad de las
longitudes de onda larga para penetrar efectivamente los tejidos biológicos, siendo preferible el
empleo de agentes fotosensibilizadores tales como: azul de metileno (AM), azul de toluidina
(AT) y el verde de malaquita (VM). Por otra parte, las fuentes de luz azul (380nm-520nm), utili-
zando como fotosensibilizadores: rosa de bengala (RB), eosina (EOS) y eritrosina (ERI).(9)
Considerando lo expuesto, la presente investigación tuvo el propósito de comparar la efectividad
antimicrobiana de la terapia fotodinámica sobre las cepas de C. albicans en superficies acrílicas
para prótesis dentales, empleando láser con 660nm de longitud de onda y azul de metileno como
agente fotosensibilizador, con respecto a otros métodos terapéuticos.
MATERIAL Y MÉTODOS
Se prepararon 60 discos de resina acrílica termopolimerizable de color rosado, el que se utiliza
habitualmente para la elaboración de prótesis dentales (MARCHE Termocurable, Santiago de
Chile) de 10 mm de diámetro y 3 mm de espesor, siguiendo las instrucciones del fabricante:
proporción de polvo/líquido 3.2:1 v/v). Este procedimiento se realizó siguiendo la técnica de
moldeo por compresión termopolimerizada, a partir de patrones de cera para modelar (Cera
Reus S.A Spain) con las mismas dimensiones, siendo enmuflados con yeso ISO tipo 3 (Rapid-
proceso térmico fue a 70ºC durante 90 minutos y luego a 100ºC por 30 minutos, para dejarse
enfriar durante 30 minutos. Cada muestra se pulió con papel de lija 600 para simular una superfi-
cie rugosa y se verificó las dimensiones de los discos mediante un paquímetro digital (TOTAL,
China). Finalmente, las muestras se esterilizaron en autoclave a 121ºC por 15 minutos.
Activación de las cepas
La activación de las cepas de Candida albicans se realizó en una cámara de flujo laminar
líquido de tripticasa soya; se dejó cultivar en una estufa (THELCO Thermo Electron Corpora-
tion USA) a 37°C por 48 horas y se evaluó el crecimiento por medición de la turbidez de 0,5 en
la escala de Mc Farland, equivalente a 1x108 unidades formadoras de colonias por mililitro.
Conformación de los grupos
El microorganismo activado se inoculó en los discos de acrílico colocando 2ml de caldo de culti-
vo en pocillos individuales y se llevó a incubación en una estufa (THELCO Thermo Electron
Corporation USA) a 37°C por 48 horas. Después del tiempo de incubación, cada uno de los
discos fueron colocados en pocillos individuales de cajas de cultivo estériles según los grupos
grupos en los que se aplicó 2 ml de cada sustancia estudiada durante 5 minutos: G1 suero fisioló-
gico, G2 clorhexidina al 0,12%, G3 Nistatina al 0,001 ml/ul, mientras que, en G4 y G5 se colocó
azul de metileno al 0,005% y 0,01%, respectivamente. Posterior, se eliminaron los excesos de
colorante y se irradiaron las superficies rugosas con un láser el diodo Therapy XT (DMC, São
90s, área del spot 0,028cm2 y una dosis de energía de 321J/cm2 a 1mm de distancia de forma
perpendicular en modo continuo.
Para garantizar que la energía sea constante en cada grupo, se verificó la potencia del láser
mediante un radiómetro (DMC, São Carlos/SP, Brazil) antes de realizar cada aplicación.
Siembra de los cultivos
A continuación, se hisopó la parte rugosa de cada disco, procediendo a inocular en medio de
cultivo Sabouraud a 37°C por 48 horas.
Las cepas de Candida albicans se cultivan con mayor rapidez en medios artificiales; así, durante
las primeras 24 horas ya se puedo observar colonias de aspecto cremoso, brillante y de color
blanco y entre las 48 y 72 horas se obtiene un nivel muy alto de desarrollo. Aun sin la presencia
de oxígeno, la incubación puede realizarse de 25 a 37°C con un nivel de riesgo de debilitar su
crecimiento.(11)
Conteo de las unidades formadoras de colonias (UFC)
Transcurridas 48 horas, se realizó el conteo de las UFC de cada una de las muestras para verifi-
car el nivel de crecimiento del microorganismo por cuadrantes, utilizando un contador de colo-
nias de campo oscuro con iluminación uniforme de las placas con un aumento de 3x (QUEBEC
Darfield Colony Counter 220V/50Hz Reichert Technologies EE.UU.) (figura 1). Los datos
relativos a estas se agruparon en cuatro rangos de escala para su mejor procesamiento según
grupos experimentales: 0 a 99, 100 a 199, 200 a 300 y mayor que 300.
Figura 1. Variación de resultados en el conteo de los diferentes grupos: 1A (suero fisiológico),
1B (clorhexidina), 1C (nistatina 0,001 ml/ul), 1D (AM 0,005%) 1E (AM 0,01%)
Los datos recolectados fueron organizados en una base elaborada en el programa Microsoft
Excel para su posterior procesamiento y análisis, mediante estadísticas descriptivas de frecuen-
Los investigadores siguieron los principios de la investigación científica, cumpliendo con las
medidas de seguridad para el trabajo en el laboratorio de microbiología y la obtención de los
correspondientes permisos. El estudio contó con el aval de la carrera de Odontología de la
Universidad Central del Ecuador.
RESULTADOS
El proceso investigativo posibilitó comparar la efectividad de diversos métodos terapéuticos de
desinfección de superficies acrílicas de prótesis dentales contaminadas por Candida albicans.
Tabla 1
*Diferencias estadísticamente significativas
Los resultados obtenidos mostraron que entre ambos grupos donde se aplicó la terapia fotodiná-
mica (G4 y G5) no existió diferencias significativas, contrariamente a los observado al comparar
los datos de estos con respecto a los grupos en los que se aplicó suero fisiológico y nistatina (G1
y G3, respectivamente), con valores (p<0,05) (tabla 1).
Figura 2. Comparación de los grupos atendiendo a rangos de los valores de UFC
Las muestras presentaron un mayor crecimiento de Cándida albicans fueron en las que se utilizó
suero fisiológico (G1) y nistatina (G3), con un 100% de los valores en el rango de > 300 ufc,
observándose la mejor efectividad en los grupos donde se aplicó la terapia fotodinámica (G4 y
G5).
DISCUSIÓN
En otras investigaciones(12,13) también se reportó adecuados niveles de eficacia de la PDT con el
uso de AM como agente fotosensibilizador en infecciones bacterianas y fúngicas en afectaciones
dermatológicas, gástricas y de la cavidad oral. Aunque, debe destacarse que los reportes publica-
dos mencionan que ni el agente fotosensibilizante ni la irradiación por sí solos tienen un efecto
antimicrobiano significativo en cepas de C. albicans.(10,13,14)
En la PDT, las ROS (anión superóxido, radical hidroxilo, peróxido de hidrogeno y especialmen-
te el oxígeno singleto) son las que generan el estrés oxidativo. Estas alteran la integridad celular,
dañando el ADN, los lípidos, las proteinas y otras macromoléculas, lo que causa la muerte por
necrosis o apotosis. Además, cuando son endógenas propician una transición alcalina del ADN,
provocando daños en las purinas y/o pirimidinas y roturas dobles o sencillas en las cadenas de
nucleótidos con un efecto tóxico y mutagénico sobre las células de C. albicans.(15,16)
La dosificación del fotosensibilizador constituye un factor determinante en la eficacia de la
PDT.(17) Esta se realiza atendiendo a sensibilidad y concentración, considerando los parámetros
de irradiación con luz y concentración de oxígeno molecular disponible.(14,17,18)
Este estudio, la irradiación con láser y AM como fotosensibilizador fue el método más eficaz en
la reducción de UFC de C. albicans, empleando longitudes de onda de 660nm tal como reco-
mienda Nuñez.(17)
Pupo(14) señala que el número de UFC de C. albicans iniciales puede reducirse hasta en un
(18) hallaron una
disminución del 42%, mientras que Sousa et al.(13) reportaron un 88,6%; además de otros auto-
res(16,19) que informan el efecto fungicida significativo de este método en C. albicans.
Pasyechnikova et al.(20) considera que una mayor concentración del agente fotosensibilizador
pudiera generar agregados, alterando su banda de absorción, lo que se ha sido descrito con
sustancias como el AM y el azul de toluidina (AT); Aunque, otro criterio indica que concentra-
ciones elevadas pueden crear una barrera que impediría la difusión adecuada de la luz.(17)
Con respecto al uso de nistatina como antifúngico en infecciones cutáneas y de la mucosa origi-
nadas por Candida albicans, esta actúa uniéndose a los esteroles de su membrana celular, afec-
tando su permeabilidad, lo que provoca la eliminación de elementos intracelulares vitales.(15,21)
Así, contrariamente a los resultados obtenidos en la presente investigación, Bakhtiari et al.(22)
La clorhexidina es un detergente catiónico soluble en agua que reacciona con los lipopolisacari-
dos y fosfolipidos de la membrana celular, inhibiendo la utilización de oxígeno y causando la
muerte celular.(21) Los hallazgos del presente estudio mostraron la efectividad de esta sustancia
fue superior a la nistatina para disminuir la viabilidad de las UFC de C. albicans.
CONCLUSIONES
En ambos grupos donde se empleó la terapia fotodinámica con diferentes concentraciones de
azul de metileno y la radiación láser con una longitud de onda de 660nm, la eficacia en la reduc-
ción del número de UFC viables de C. albicans sobre superficies acrílicas fue superior al uso de
otros métodos mediante la aplicación de sustancias antifúngicas. Los grupos uno (suero fisioló-
gico) y tres (nistatina) constituyeron los métodos con menores valores de eficacia al respecto.
Agradecimientos: a los funcionarios del laboratorio de microbiología de la Facultad de la
Bioquímica de la Universidad Central del Ecuador por su valioso aporte en esta investigación.
Conflicto de intereses: los autores declaran que no existe.
Declaración de contribución: existió una participación homogénea y activa en la investiga-
ción, recolección de información científica actualizada y la redacción del artículo.
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Recibido: 19 de enero de 2022
Aprobado: 24 de marzo de 2022
Terapia fotodinámica antimicrobiana sobre Candida albicans en superficies acrílicas de
prótesis dentales. Estudio in vitro
Antimicrobial photodynamic therapy on Candida albicans on acrylic surfaces of dental
prostheses. In vitro study
https://doi.org/10.37135/ee.04.15.08
Autores:
María Alejandra Jarrín Ríos - https//orcid.org/0000-0002-6358-9962
Maria Fernanda Caicedo Breeddy - https//orcid.org/0000-0002-3118-196
Pablo Ruben Garrido Villavicencio1,2 - https//orcid.org/000-0002-5223-1017
Héctor Eduardo Cepeda Inca1,2 - https//orcid.org/0000-0003-0567-6096
Universidad Central del Ecuador, Quito-Ecuador.
Facultad de Odontología, Universidad de Sao Paulo, Sao Paulo-Brasil.
Autor de correspondencia: Héctor Eduardo Cepeda Inca, Facultad de Odontología, Universi-
dad Central del Ecuador, Avenida América, Quito Ecuador. Email: hecepeda@uce.edu.ec.
RESUMEN
Frecuentemente, se hayan especies del género Candida en la microbiota oral de los humanos.
Objetivo: comparar la efectividad antimicrobiana de la terapia fotodinámica sobre las cepas de
Candida albicans en superficies acrílicas para prótesis dentales, empleando láser con 660nm de
longitud de onda y azul de metileno como agente fotosensibilizador, con respecto a otros méto-
dos terapéuticos. Metodología: estudio in vitro, empleando 60 discos de acrílico de termocurado
sumergidos en una suspensión de C. albicans, generando una simulación de biofilm sobre la
superficie de una prótesis dental. Luego se conformaron cinco grupos al azar de 12 unidades a
los que se aplicó diferentes procedimientos terapéuticos: G1 (suero fisiológico), G2 (clorhexidi-
na al 0,12%), G3 (nistatina en solución tópica en 0,001ml/ul), G4 (azul de metileno al 0,005% +
-
tiva al comparar los grupos G4 y G5 con respecto a los G1 y G3 (p<0,05). Conclusión: la efica-
cia en la reducción del número de UFC viables de C. albicans resultó superior en los grupos
donde se empleó radiación láser con una longitud de onda de 660nm con diferentes concentra-
ciones de azul de metileno. El uso de nistatina y de suero fisiológico tuvieron los menores valo-
res de eficacia.
Palabras clave: fotoquimioterapia, terapia por láser, candidiasis bucal, prótesis dental.
ABSTRACT
Species of the genus Candida are frequently found in the oral microbiota of humans. Objective:
to compare the antimicrobial effectiveness of photodynamic therapy on Candida albicans
strains on acrylic surfaces for dental prostheses by using a 660nm wavelength laser and methyle-
ne blue as a photosensitizing agent, with respect to other therapeutic methods. Methodology: in
vitro study, using 60 thermosetting acrylic discs immersed in a suspension of C. albicans, gene-
rating a biofilm simulation on the surface of a dental prosthesis. After that, five random groups
of 12 units were formed to apply them different therapeutic procedures: G1 (saline solution), G2
(chlorhexidine 0.12%), G3 (nystatin in topical solution at 0.001ml/ul), G4 (0.005% methylene
observed when comparing groups G4 and G5 with respect to G1 and G3 (p<0.05). Conclusion:
the efficacy in reducing the number of viable C. albicans CFU was higher in the groups where
laser radiation with a wavelength of 660nm was used with different concentrations of methylene
blue. The use of nystatin and physiological saline had the lowest efficacy values.
Keywords: Photochemotherapy; Laser Therapy; Candidiasis, Oral; Dental Prosthesis.
INTRODUCCIÓN
Las especies del género Candida se hallan frecuentemente en la microbiota oral de los huma-
nos.(1) En la mayoría de los individuos, este microorganismo reside como un huésped inofensivo;
sin embargo, ante factores predisponentes, pueden causar infecciones que van desde lesiones
superficiales de la mucosa hasta procesos sistémicos que amenazan la vida.(2-4)
Candida albicans es un hongo dimórfico capaz de evadir los mecanismos de defensa del hués-
ped, permitiéndole colonizar el epitelio a través de la secreción de enzimas hidrolíticas tales
como: proteinasas y fosfolipasas; lo que produce metabolitos ácidos, otras sustancias tóxicas y
la transición fenotípica de blastosporas a hifas o pseudohifas.(1,5) Esa capacidad de adherencia
favorece el desarrollo de estomatitis por prótesis dental (EPD) que se puede agravar ante eleva-
do consumo de azúcar.(3)
El uso de prótesis dentales acrílicas se relaciona con infecciones por Candida albicans, princi-
palmente, si existe potencial contaminación por exceder la vida útil de la prótesis y una deficien-
te higiene oral.(1)
Este tipo de infección dificulta la alimentación debido a la presencia de sangrado y exudado,
acompañado de ardor, dolor, halitosis, gusto desagradable y sequedad bucal.(4)
El control de las infecciones por Candida albicans resulta difícil por su naturaleza multifacto-
rial.(4) El tratamiento más empleado se basa en la medicación mediante antifúngicos en diferen-
tes presentaciones: tabletas, enjuagues y antisépticos para la desinfección de la prótesis. Aunque,
se exploran otros tratamientos por el incremento de la resistencia microbiológica a los medica-
mentos de elección.(5,6)
La terapia fotodinámica (PDT, por sus siglas del inglés Photodynamic Therapy) constituye un
procedimiento terapéutico alternativo para la inactivación de microorganismos patógenos.(6,7)
Este consiste en la administración de un agente fotosensibilizante que se irradia con una longitud
de onda específica, produciéndose especies reactivas de oxígeno (ROS) que provocan la muerte
del hongo.(8,9)
Existen dos mecanimos para la producción de ROS:(10)
• Tipo I, mediante transferencia de electrones al O que produce: superóxido, peróxido de
hidrógeno e hidroxilo.
• Tipo II, a través de transferencia de energía que produce oxígeno singlete.
Al acumularse o atravesar la membrana citoplasmática, el agente fotosensibilizador provoca
daños irreversibles en las bacterias después de la irradiación. La efectividad de la PDT depende-
rá de la longitud de onda aplicada, la concentración el agente fotosensibilizador, el tiempo de
irradiación, la potencia de salida, el modo de irradiación (continuo o pulsado) y la convergencia
del haz de luz.(6,9)
Así, en el uso de PDT se emplea fuentes de luz roja (630nm-700nm) por la capacidad de las
longitudes de onda larga para penetrar efectivamente los tejidos biológicos, siendo preferible el
empleo de agentes fotosensibilizadores tales como: azul de metileno (AM), azul de toluidina
(AT) y el verde de malaquita (VM). Por otra parte, las fuentes de luz azul (380nm-520nm), utili-
zando como fotosensibilizadores: rosa de bengala (RB), eosina (EOS) y eritrosina (ERI).(9)
Considerando lo expuesto, la presente investigación tuvo el propósito de comparar la efectividad
antimicrobiana de la terapia fotodinámica sobre las cepas de C. albicans en superficies acrílicas
para prótesis dentales, empleando láser con 660nm de longitud de onda y azul de metileno como
agente fotosensibilizador, con respecto a otros métodos terapéuticos.
MATERIAL Y MÉTODOS
Se prepararon 60 discos de resina acrílica termopolimerizable de color rosado, el que se utiliza
habitualmente para la elaboración de prótesis dentales (MARCHE Termocurable, Santiago de
Chile) de 10 mm de diámetro y 3 mm de espesor, siguiendo las instrucciones del fabricante:
proporción de polvo/líquido 3.2:1 v/v). Este procedimiento se realizó siguiendo la técnica de
moldeo por compresión termopolimerizada, a partir de patrones de cera para modelar (Cera
Reus S.A Spain) con las mismas dimensiones, siendo enmuflados con yeso ISO tipo 3 (Rapid-
proceso térmico fue a 70ºC durante 90 minutos y luego a 100ºC por 30 minutos, para dejarse
enfriar durante 30 minutos. Cada muestra se pulió con papel de lija 600 para simular una superfi-
cie rugosa y se verificó las dimensiones de los discos mediante un paquímetro digital (TOTAL,
China). Finalmente, las muestras se esterilizaron en autoclave a 121ºC por 15 minutos.
Activación de las cepas
La activación de las cepas de Candida albicans se realizó en una cámara de flujo laminar
líquido de tripticasa soya; se dejó cultivar en una estufa (THELCO Thermo Electron Corpora-
tion USA) a 37°C por 48 horas y se evaluó el crecimiento por medición de la turbidez de 0,5 en
la escala de Mc Farland, equivalente a 1x108 unidades formadoras de colonias por mililitro.
Conformación de los grupos
El microorganismo activado se inoculó en los discos de acrílico colocando 2ml de caldo de culti-
vo en pocillos individuales y se llevó a incubación en una estufa (THELCO Thermo Electron
Corporation USA) a 37°C por 48 horas. Después del tiempo de incubación, cada uno de los
discos fueron colocados en pocillos individuales de cajas de cultivo estériles según los grupos
grupos en los que se aplicó 2 ml de cada sustancia estudiada durante 5 minutos: G1 suero fisioló-
gico, G2 clorhexidina al 0,12%, G3 Nistatina al 0,001 ml/ul, mientras que, en G4 y G5 se colocó
azul de metileno al 0,005% y 0,01%, respectivamente. Posterior, se eliminaron los excesos de
colorante y se irradiaron las superficies rugosas con un láser el diodo Therapy XT (DMC, São
90s, área del spot 0,028cm2 y una dosis de energía de 321J/cm2 a 1mm de distancia de forma
perpendicular en modo continuo.
Para garantizar que la energía sea constante en cada grupo, se verificó la potencia del láser
mediante un radiómetro (DMC, São Carlos/SP, Brazil) antes de realizar cada aplicación.
Siembra de los cultivos
A continuación, se hisopó la parte rugosa de cada disco, procediendo a inocular en medio de
cultivo Sabouraud a 37°C por 48 horas.
Las cepas de Candida albicans se cultivan con mayor rapidez en medios artificiales; así, durante
las primeras 24 horas ya se puedo observar colonias de aspecto cremoso, brillante y de color
blanco y entre las 48 y 72 horas se obtiene un nivel muy alto de desarrollo. Aun sin la presencia
de oxígeno, la incubación puede realizarse de 25 a 37°C con un nivel de riesgo de debilitar su
crecimiento.(11)
Conteo de las unidades formadoras de colonias (UFC)
Transcurridas 48 horas, se realizó el conteo de las UFC de cada una de las muestras para verifi-
car el nivel de crecimiento del microorganismo por cuadrantes, utilizando un contador de colo-
nias de campo oscuro con iluminación uniforme de las placas con un aumento de 3x (QUEBEC
Darfield Colony Counter 220V/50Hz Reichert Technologies EE.UU.) (figura 1). Los datos
relativos a estas se agruparon en cuatro rangos de escala para su mejor procesamiento según
grupos experimentales: 0 a 99, 100 a 199, 200 a 300 y mayor que 300.
Figura 1. Variación de resultados en el conteo de los diferentes grupos: 1A (suero fisiológico),
1B (clorhexidina), 1C (nistatina 0,001 ml/ul), 1D (AM 0,005%) 1E (AM 0,01%)
Los datos recolectados fueron organizados en una base elaborada en el programa Microsoft
Excel para su posterior procesamiento y análisis, mediante estadísticas descriptivas de frecuen-
Los investigadores siguieron los principios de la investigación científica, cumpliendo con las
medidas de seguridad para el trabajo en el laboratorio de microbiología y la obtención de los
correspondientes permisos. El estudio contó con el aval de la carrera de Odontología de la
Universidad Central del Ecuador.
RESULTADOS
El proceso investigativo posibilitó comparar la efectividad de diversos métodos terapéuticos de
desinfección de superficies acrílicas de prótesis dentales contaminadas por Candida albicans.
Tabla 1
*Diferencias estadísticamente significativas
Los resultados obtenidos mostraron que entre ambos grupos donde se aplicó la terapia fotodiná-
mica (G4 y G5) no existió diferencias significativas, contrariamente a los observado al comparar
los datos de estos con respecto a los grupos en los que se aplicó suero fisiológico y nistatina (G1
y G3, respectivamente), con valores (p<0,05) (tabla 1).
Figura 2. Comparación de los grupos atendiendo a rangos de los valores de UFC
Las muestras presentaron un mayor crecimiento de Cándida albicans fueron en las que se utilizó
suero fisiológico (G1) y nistatina (G3), con un 100% de los valores en el rango de > 300 ufc,
observándose la mejor efectividad en los grupos donde se aplicó la terapia fotodinámica (G4 y
G5).
DISCUSIÓN
En otras investigaciones(12,13) también se reportó adecuados niveles de eficacia de la PDT con el
uso de AM como agente fotosensibilizador en infecciones bacterianas y fúngicas en afectaciones
dermatológicas, gástricas y de la cavidad oral. Aunque, debe destacarse que los reportes publica-
dos mencionan que ni el agente fotosensibilizante ni la irradiación por sí solos tienen un efecto
antimicrobiano significativo en cepas de C. albicans.(10,13,14)
En la PDT, las ROS (anión superóxido, radical hidroxilo, peróxido de hidrogeno y especialmen-
te el oxígeno singleto) son las que generan el estrés oxidativo. Estas alteran la integridad celular,
dañando el ADN, los lípidos, las proteinas y otras macromoléculas, lo que causa la muerte por
necrosis o apotosis. Además, cuando son endógenas propician una transición alcalina del ADN,
provocando daños en las purinas y/o pirimidinas y roturas dobles o sencillas en las cadenas de
nucleótidos con un efecto tóxico y mutagénico sobre las células de C. albicans.(15,16)
La dosificación del fotosensibilizador constituye un factor determinante en la eficacia de la
PDT.(17) Esta se realiza atendiendo a sensibilidad y concentración, considerando los parámetros
de irradiación con luz y concentración de oxígeno molecular disponible.(14,17,18)
Este estudio, la irradiación con láser y AM como fotosensibilizador fue el método más eficaz en
la reducción de UFC de C. albicans, empleando longitudes de onda de 660nm tal como reco-
mienda Nuñez.(17)
Pupo(14) señala que el número de UFC de C. albicans iniciales puede reducirse hasta en un
(18) hallaron una
disminución del 42%, mientras que Sousa et al.(13) reportaron un 88,6%; además de otros auto-
res(16,19) que informan el efecto fungicida significativo de este método en C. albicans.
Pasyechnikova et al.(20) considera que una mayor concentración del agente fotosensibilizador
pudiera generar agregados, alterando su banda de absorción, lo que se ha sido descrito con
sustancias como el AM y el azul de toluidina (AT); Aunque, otro criterio indica que concentra-
ciones elevadas pueden crear una barrera que impediría la difusión adecuada de la luz.(17)
Con respecto al uso de nistatina como antifúngico en infecciones cutáneas y de la mucosa origi-
nadas por Candida albicans, esta actúa uniéndose a los esteroles de su membrana celular, afec-
tando su permeabilidad, lo que provoca la eliminación de elementos intracelulares vitales.(15,21)
Así, contrariamente a los resultados obtenidos en la presente investigación, Bakhtiari et al.(22)
La clorhexidina es un detergente catiónico soluble en agua que reacciona con los lipopolisacari-
dos y fosfolipidos de la membrana celular, inhibiendo la utilización de oxígeno y causando la
muerte celular.(21) Los hallazgos del presente estudio mostraron la efectividad de esta sustancia
fue superior a la nistatina para disminuir la viabilidad de las UFC de C. albicans.
CONCLUSIONES
En ambos grupos donde se empleó la terapia fotodinámica con diferentes concentraciones de
azul de metileno y la radiación láser con una longitud de onda de 660nm, la eficacia en la reduc-
ción del número de UFC viables de C. albicans sobre superficies acrílicas fue superior al uso de
otros métodos mediante la aplicación de sustancias antifúngicas. Los grupos uno (suero fisioló-
gico) y tres (nistatina) constituyeron los métodos con menores valores de eficacia al respecto.
Agradecimientos: a los funcionarios del laboratorio de microbiología de la Facultad de la
Bioquímica de la Universidad Central del Ecuador por su valioso aporte en esta investigación.
Conflicto de intereses: los autores declaran que no existe.
Declaración de contribución: existió una participación homogénea y activa en la investiga-
ción, recolección de información científica actualizada y la redacción del artículo.
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ISSN-digital 2661-6742
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Recibido: 19 de enero de 2022
Aprobado: 24 de marzo de 2022
Terapia fotodinámica antimicrobiana sobre Candida albicans en superficies acrílicas de
prótesis dentales. Estudio in vitro
Antimicrobial photodynamic therapy on Candida albicans on acrylic surfaces of dental
prostheses. In vitro study
https://doi.org/10.37135/ee.04.15.08
Autores:
María Alejandra Jarrín Ríos - https//orcid.org/0000-0002-6358-9962
Maria Fernanda Caicedo Breeddy - https//orcid.org/0000-0002-3118-196
Pablo Ruben Garrido Villavicencio1,2 - https//orcid.org/000-0002-5223-1017
Héctor Eduardo Cepeda Inca1,2 - https//orcid.org/0000-0003-0567-6096
Universidad Central del Ecuador, Quito-Ecuador.
Facultad de Odontología, Universidad de Sao Paulo, Sao Paulo-Brasil.
Autor de correspondencia: Héctor Eduardo Cepeda Inca, Facultad de Odontología, Universi-
dad Central del Ecuador, Avenida América, Quito Ecuador. Email: hecepeda@uce.edu.ec.
RESUMEN
Frecuentemente, se hayan especies del género Candida en la microbiota oral de los humanos.
Objetivo: comparar la efectividad antimicrobiana de la terapia fotodinámica sobre las cepas de
Candida albicans en superficies acrílicas para prótesis dentales, empleando láser con 660nm de
longitud de onda y azul de metileno como agente fotosensibilizador, con respecto a otros méto-
dos terapéuticos. Metodología: estudio in vitro, empleando 60 discos de acrílico de termocurado
sumergidos en una suspensión de C. albicans, generando una simulación de biofilm sobre la
superficie de una prótesis dental. Luego se conformaron cinco grupos al azar de 12 unidades a
los que se aplicó diferentes procedimientos terapéuticos: G1 (suero fisiológico), G2 (clorhexidi-
na al 0,12%), G3 (nistatina en solución tópica en 0,001ml/ul), G4 (azul de metileno al 0,005% +
-
tiva al comparar los grupos G4 y G5 con respecto a los G1 y G3 (p<0,05). Conclusión: la efica-
cia en la reducción del número de UFC viables de C. albicans resultó superior en los grupos
donde se empleó radiación láser con una longitud de onda de 660nm con diferentes concentra-
ciones de azul de metileno. El uso de nistatina y de suero fisiológico tuvieron los menores valo-
res de eficacia.
Palabras clave: fotoquimioterapia, terapia por láser, candidiasis bucal, prótesis dental.
ABSTRACT
Species of the genus Candida are frequently found in the oral microbiota of humans. Objective:
to compare the antimicrobial effectiveness of photodynamic therapy on Candida albicans
strains on acrylic surfaces for dental prostheses by using a 660nm wavelength laser and methyle-
ne blue as a photosensitizing agent, with respect to other therapeutic methods. Methodology: in
vitro study, using 60 thermosetting acrylic discs immersed in a suspension of C. albicans, gene-
rating a biofilm simulation on the surface of a dental prosthesis. After that, five random groups
of 12 units were formed to apply them different therapeutic procedures: G1 (saline solution), G2
(chlorhexidine 0.12%), G3 (nystatin in topical solution at 0.001ml/ul), G4 (0.005% methylene
observed when comparing groups G4 and G5 with respect to G1 and G3 (p<0.05). Conclusion:
the efficacy in reducing the number of viable C. albicans CFU was higher in the groups where
laser radiation with a wavelength of 660nm was used with different concentrations of methylene
blue. The use of nystatin and physiological saline had the lowest efficacy values.
Keywords: Photochemotherapy; Laser Therapy; Candidiasis, Oral; Dental Prosthesis.
INTRODUCCIÓN
Las especies del género Candida se hallan frecuentemente en la microbiota oral de los huma-
nos.(1) En la mayoría de los individuos, este microorganismo reside como un huésped inofensivo;
sin embargo, ante factores predisponentes, pueden causar infecciones que van desde lesiones
superficiales de la mucosa hasta procesos sistémicos que amenazan la vida.(2-4)
Candida albicans es un hongo dimórfico capaz de evadir los mecanismos de defensa del hués-
ped, permitiéndole colonizar el epitelio a través de la secreción de enzimas hidrolíticas tales
como: proteinasas y fosfolipasas; lo que produce metabolitos ácidos, otras sustancias tóxicas y
la transición fenotípica de blastosporas a hifas o pseudohifas.(1,5) Esa capacidad de adherencia
favorece el desarrollo de estomatitis por prótesis dental (EPD) que se puede agravar ante eleva-
do consumo de azúcar.(3)
El uso de prótesis dentales acrílicas se relaciona con infecciones por Candida albicans, princi-
palmente, si existe potencial contaminación por exceder la vida útil de la prótesis y una deficien-
te higiene oral.(1)
Este tipo de infección dificulta la alimentación debido a la presencia de sangrado y exudado,
acompañado de ardor, dolor, halitosis, gusto desagradable y sequedad bucal.(4)
El control de las infecciones por Candida albicans resulta difícil por su naturaleza multifacto-
rial.(4) El tratamiento más empleado se basa en la medicación mediante antifúngicos en diferen-
tes presentaciones: tabletas, enjuagues y antisépticos para la desinfección de la prótesis. Aunque,
se exploran otros tratamientos por el incremento de la resistencia microbiológica a los medica-
mentos de elección.(5,6)
La terapia fotodinámica (PDT, por sus siglas del inglés Photodynamic Therapy) constituye un
procedimiento terapéutico alternativo para la inactivación de microorganismos patógenos.(6,7)
Este consiste en la administración de un agente fotosensibilizante que se irradia con una longitud
de onda específica, produciéndose especies reactivas de oxígeno (ROS) que provocan la muerte
del hongo.(8,9)
Existen dos mecanimos para la producción de ROS:(10)
• Tipo I, mediante transferencia de electrones al O que produce: superóxido, peróxido de
hidrógeno e hidroxilo.
• Tipo II, a través de transferencia de energía que produce oxígeno singlete.
Al acumularse o atravesar la membrana citoplasmática, el agente fotosensibilizador provoca
daños irreversibles en las bacterias después de la irradiación. La efectividad de la PDT depende-
rá de la longitud de onda aplicada, la concentración el agente fotosensibilizador, el tiempo de
irradiación, la potencia de salida, el modo de irradiación (continuo o pulsado) y la convergencia
del haz de luz.(6,9)
Así, en el uso de PDT se emplea fuentes de luz roja (630nm-700nm) por la capacidad de las
longitudes de onda larga para penetrar efectivamente los tejidos biológicos, siendo preferible el
empleo de agentes fotosensibilizadores tales como: azul de metileno (AM), azul de toluidina
(AT) y el verde de malaquita (VM). Por otra parte, las fuentes de luz azul (380nm-520nm), utili-
zando como fotosensibilizadores: rosa de bengala (RB), eosina (EOS) y eritrosina (ERI).(9)
Considerando lo expuesto, la presente investigación tuvo el propósito de comparar la efectividad
antimicrobiana de la terapia fotodinámica sobre las cepas de C. albicans en superficies acrílicas
para prótesis dentales, empleando láser con 660nm de longitud de onda y azul de metileno como
agente fotosensibilizador, con respecto a otros métodos terapéuticos.
MATERIAL Y MÉTODOS
Se prepararon 60 discos de resina acrílica termopolimerizable de color rosado, el que se utiliza
habitualmente para la elaboración de prótesis dentales (MARCHE Termocurable, Santiago de
Chile) de 10 mm de diámetro y 3 mm de espesor, siguiendo las instrucciones del fabricante:
proporción de polvo/líquido 3.2:1 v/v). Este procedimiento se realizó siguiendo la técnica de
moldeo por compresión termopolimerizada, a partir de patrones de cera para modelar (Cera
Reus S.A Spain) con las mismas dimensiones, siendo enmuflados con yeso ISO tipo 3 (Rapid-
proceso térmico fue a 70ºC durante 90 minutos y luego a 100ºC por 30 minutos, para dejarse
enfriar durante 30 minutos. Cada muestra se pulió con papel de lija 600 para simular una superfi-
cie rugosa y se verificó las dimensiones de los discos mediante un paquímetro digital (TOTAL,
China). Finalmente, las muestras se esterilizaron en autoclave a 121ºC por 15 minutos.
Activación de las cepas
La activación de las cepas de Candida albicans se realizó en una cámara de flujo laminar
líquido de tripticasa soya; se dejó cultivar en una estufa (THELCO Thermo Electron Corpora-
tion USA) a 37°C por 48 horas y se evaluó el crecimiento por medición de la turbidez de 0,5 en
la escala de Mc Farland, equivalente a 1x108 unidades formadoras de colonias por mililitro.
Conformación de los grupos
El microorganismo activado se inoculó en los discos de acrílico colocando 2ml de caldo de culti-
vo en pocillos individuales y se llevó a incubación en una estufa (THELCO Thermo Electron
Corporation USA) a 37°C por 48 horas. Después del tiempo de incubación, cada uno de los
discos fueron colocados en pocillos individuales de cajas de cultivo estériles según los grupos
grupos en los que se aplicó 2 ml de cada sustancia estudiada durante 5 minutos: G1 suero fisioló-
gico, G2 clorhexidina al 0,12%, G3 Nistatina al 0,001 ml/ul, mientras que, en G4 y G5 se colocó
azul de metileno al 0,005% y 0,01%, respectivamente. Posterior, se eliminaron los excesos de
colorante y se irradiaron las superficies rugosas con un láser el diodo Therapy XT (DMC, São
90s, área del spot 0,028cm2 y una dosis de energía de 321J/cm2 a 1mm de distancia de forma
perpendicular en modo continuo.
Para garantizar que la energía sea constante en cada grupo, se verificó la potencia del láser
mediante un radiómetro (DMC, São Carlos/SP, Brazil) antes de realizar cada aplicación.
Siembra de los cultivos
A continuación, se hisopó la parte rugosa de cada disco, procediendo a inocular en medio de
cultivo Sabouraud a 37°C por 48 horas.
Las cepas de Candida albicans se cultivan con mayor rapidez en medios artificiales; así, durante
las primeras 24 horas ya se puedo observar colonias de aspecto cremoso, brillante y de color
blanco y entre las 48 y 72 horas se obtiene un nivel muy alto de desarrollo. Aun sin la presencia
de oxígeno, la incubación puede realizarse de 25 a 37°C con un nivel de riesgo de debilitar su
crecimiento.(11)
Conteo de las unidades formadoras de colonias (UFC)
Transcurridas 48 horas, se realizó el conteo de las UFC de cada una de las muestras para verifi-
car el nivel de crecimiento del microorganismo por cuadrantes, utilizando un contador de colo-
nias de campo oscuro con iluminación uniforme de las placas con un aumento de 3x (QUEBEC
Darfield Colony Counter 220V/50Hz Reichert Technologies EE.UU.) (figura 1). Los datos
relativos a estas se agruparon en cuatro rangos de escala para su mejor procesamiento según
grupos experimentales: 0 a 99, 100 a 199, 200 a 300 y mayor que 300.
Figura 1. Variación de resultados en el conteo de los diferentes grupos: 1A (suero fisiológico),
1B (clorhexidina), 1C (nistatina 0,001 ml/ul), 1D (AM 0,005%) 1E (AM 0,01%)
Los datos recolectados fueron organizados en una base elaborada en el programa Microsoft
Excel para su posterior procesamiento y análisis, mediante estadísticas descriptivas de frecuen-
Los investigadores siguieron los principios de la investigación científica, cumpliendo con las
medidas de seguridad para el trabajo en el laboratorio de microbiología y la obtención de los
correspondientes permisos. El estudio contó con el aval de la carrera de Odontología de la
Universidad Central del Ecuador.
RESULTADOS
El proceso investigativo posibilitó comparar la efectividad de diversos métodos terapéuticos de
desinfección de superficies acrílicas de prótesis dentales contaminadas por Candida albicans.
Tabla 1
*Diferencias estadísticamente significativas
Los resultados obtenidos mostraron que entre ambos grupos donde se aplicó la terapia fotodiná-
mica (G4 y G5) no existió diferencias significativas, contrariamente a los observado al comparar
los datos de estos con respecto a los grupos en los que se aplicó suero fisiológico y nistatina (G1
y G3, respectivamente), con valores (p<0,05) (tabla 1).
Figura 2. Comparación de los grupos atendiendo a rangos de los valores de UFC
Las muestras presentaron un mayor crecimiento de Cándida albicans fueron en las que se utilizó
suero fisiológico (G1) y nistatina (G3), con un 100% de los valores en el rango de > 300 ufc,
observándose la mejor efectividad en los grupos donde se aplicó la terapia fotodinámica (G4 y
G5).
DISCUSIÓN
En otras investigaciones(12,13) también se reportó adecuados niveles de eficacia de la PDT con el
uso de AM como agente fotosensibilizador en infecciones bacterianas y fúngicas en afectaciones
dermatológicas, gástricas y de la cavidad oral. Aunque, debe destacarse que los reportes publica-
dos mencionan que ni el agente fotosensibilizante ni la irradiación por sí solos tienen un efecto
antimicrobiano significativo en cepas de C. albicans.(10,13,14)
En la PDT, las ROS (anión superóxido, radical hidroxilo, peróxido de hidrogeno y especialmen-
te el oxígeno singleto) son las que generan el estrés oxidativo. Estas alteran la integridad celular,
dañando el ADN, los lípidos, las proteinas y otras macromoléculas, lo que causa la muerte por
necrosis o apotosis. Además, cuando son endógenas propician una transición alcalina del ADN,
provocando daños en las purinas y/o pirimidinas y roturas dobles o sencillas en las cadenas de
nucleótidos con un efecto tóxico y mutagénico sobre las células de C. albicans.(15,16)
La dosificación del fotosensibilizador constituye un factor determinante en la eficacia de la
PDT.(17) Esta se realiza atendiendo a sensibilidad y concentración, considerando los parámetros
de irradiación con luz y concentración de oxígeno molecular disponible.(14,17,18)
Este estudio, la irradiación con láser y AM como fotosensibilizador fue el método más eficaz en
la reducción de UFC de C. albicans, empleando longitudes de onda de 660nm tal como reco-
mienda Nuñez.(17)
Pupo(14) señala que el número de UFC de C. albicans iniciales puede reducirse hasta en un
(18) hallaron una
disminución del 42%, mientras que Sousa et al.(13) reportaron un 88,6%; además de otros auto-
res(16,19) que informan el efecto fungicida significativo de este método en C. albicans.
Pasyechnikova et al.(20) considera que una mayor concentración del agente fotosensibilizador
pudiera generar agregados, alterando su banda de absorción, lo que se ha sido descrito con
sustancias como el AM y el azul de toluidina (AT); Aunque, otro criterio indica que concentra-
ciones elevadas pueden crear una barrera que impediría la difusión adecuada de la luz.(17)
Con respecto al uso de nistatina como antifúngico en infecciones cutáneas y de la mucosa origi-
nadas por Candida albicans, esta actúa uniéndose a los esteroles de su membrana celular, afec-
tando su permeabilidad, lo que provoca la eliminación de elementos intracelulares vitales.(15,21)
Así, contrariamente a los resultados obtenidos en la presente investigación, Bakhtiari et al.(22)
La clorhexidina es un detergente catiónico soluble en agua que reacciona con los lipopolisacari-
dos y fosfolipidos de la membrana celular, inhibiendo la utilización de oxígeno y causando la
muerte celular.(21) Los hallazgos del presente estudio mostraron la efectividad de esta sustancia
fue superior a la nistatina para disminuir la viabilidad de las UFC de C. albicans.
CONCLUSIONES
En ambos grupos donde se empleó la terapia fotodinámica con diferentes concentraciones de
azul de metileno y la radiación láser con una longitud de onda de 660nm, la eficacia en la reduc-
ción del número de UFC viables de C. albicans sobre superficies acrílicas fue superior al uso de
otros métodos mediante la aplicación de sustancias antifúngicas. Los grupos uno (suero fisioló-
gico) y tres (nistatina) constituyeron los métodos con menores valores de eficacia al respecto.
Agradecimientos: a los funcionarios del laboratorio de microbiología de la Facultad de la
Bioquímica de la Universidad Central del Ecuador por su valioso aporte en esta investigación.
Conflicto de intereses: los autores declaran que no existe.
Declaración de contribución: existió una participación homogénea y activa en la investiga-
ción, recolección de información científica actualizada y la redacción del artículo.
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Recibido: 19 de enero de 2022
Aprobado: 24 de marzo de 2022
