REE Volumen 15(1) Riobamba ene. - abr. 2021
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
ISSN-impreso 1390-7581
ISSN-digital 2661-6742
Evaluación de la susceptibilidad de Enterococcus faecalis ATCC-29212 frente a medica-
mentos combinados con hidróxido de calcio
Evaluation of the susceptibility of Enterococcus faecalis ATCC-29212 to drugs combined
with calcium hydroxide
https://doi.org/10.37135/ee.04.10.02
Autores:
Doménica Mishelly Rodríguez Robalino1 – https://orcid.org/00000002-0261-4909
Silvia Alexandra Reinoso Ortiz2 – https://orcid.org/00000002-8895-8947
Silvia Verónica Vallejo Lara2 – https://orcid.org/00000001-9857-4157
Paola Natali Paredes Chinizaca2– https://orcid.org/0000-0003-0453-7019
1Centro de Salud Tipo B Guano, Guano, Ecuador
2Universidad Nacional de Chimborazo, Riobamba, Ecuador
Autor de correspondencia: Silvia Alexandra Reinoso Ortiz. Universidad Nacional de Chimbo-
razo. Av. Antonio José de Sucre, Via a Guano. Riobamba, Chimborazo Ecuador. Teléfono:
0998285461. Email: sreinoso@unach.edu.ec
RESUMEN
La elevada incidencia del Enterococcus faecalis en procedimientos odontológicos es un tópico de
interés para el área de la salud, esta bacteria resiste a varios antimicrobianos y su proliferación
aumenta debido a su baja susceptibilidad a sustancias de uso convencional como el hidróxido de
calcio, convirtiéndose en una de las principales causas del fracaso de los tratamientos de conduc-
to. La presente investigación evaluó la susceptibilidad in vitro del Enterococcus faecalis cepa
ATCC-29212 frente a la combinación de sustancias y antibióticos con el hidróxido de calcio. Se
utilizó la técnica de difusión en agar, inoculando el microorganismo en cajas de Petri con agar
Cerebro Corazón (BHI), tratado con discos de papel filtro impregnados con 1µl de cada trata-
miento por triplicado; T1 (Hidróxido de Calcio + propilenglicol), T2 (Hidróxido de Calcio +
paramonoclorofenol), T3 (Hidróxido de Calcio + ampicilina gentamicina + propilenglicol), T4
(Hidróxido de Calcio + Solución Salina Fisiológica), Control positivo (medicamento comercial a
base de Hidróxido de Calcio), se incubó a 35°C durante 24h, los halos formados alrededor de
cada disco fueron medidos y comparados con la escala de Duraffourd y procesados mediante
ANOVA de un factor. Se obtuvo una medida del halo de inhibición de 22,50±3,3 mm, con el trata-
miento T3, siendo sumamente sensible. Concluyendo que este resultó el más efectivo en compa-
ración el resto de la pruebas in vitro en comparación con el resto de los fármaco investigados.
Palabras clave: Enterococcus faecalis, hidróxido de calcio, ampicilina, gentamicina.
ABSTRACT
The high incidence of Enterococcus faecalis in dental procedures is a topic of interest for the
health area. This bacterium resists various antimicrobials and its proliferation increases due to
its low susceptibility to substances of conventional use such as calcium hydroxide, becoming a
of the main causes of root canal failure. The present investigation evaluated the in vitro suscepti-
bility of Enterococcus faecalis strain ATCC-29212 to the combination of substances and antibio-
tics with calcium hydroxide. The agar diffusion technique was used, inoculating the microorga-
nism in Petri dishes with Brain Heart agar (BHI), treated with filter paper disks impregnated
with 1µl of each treatment in triplicate; T1 (Calcium Hydroxide + propylene glycol), T2 (Cal-
cium Hydroxide + paramonochlorophenol), T3 (Calcium Hydroxide + ampicillin gentamicin +
propylene glycol), T4 (Calcium Hydroxide + Physiological Saline Solution), Positive control
(Hydroxide-based commercial medicine Calcium), incubated at 35 ° C for 24h, the halos formed
around each disc were measured and compared with the Duraffourd scale and processed by
one-factor ANOVA. A measure of the inhibition halo of 22.50 ± 3.3 mm was obtained with the
T3 treatment, being extremely sensitive. It was concluded that this was the most effective in
comparison with the rest of the in vitro tests of the rest of the investigated drugs.
Keywords: Enterococcus Faecalis, Calcium Hydroxide, Ampicillin, Gentamicin.
INTRODUCCIÓN
Enterococcus faecalis es un microorganismo anaerobio facultativo, Gram positivo, inmóvil, no
esporulado que coloniza el tracto gastrointestinal y forma parte de la microbiota normal de la
saliva.
(1,2)
Sin embargo, con la aparición de la terapia antibiótica, se ha convertido en un patóge-
no oportunista resistente que puede permanecer dentro de los conductos radiculares incluso
después de la instrumentación endodóntica,
(3,4)
siendo una de las principales causas del fracaso
en el tratamiento de conducto, debido a que componentes estructurales como el colágeno y la
fibronectina ayudan a la adhesión de la bacteria en tejidos y dentina. También favorece la apari-
ción de enfermedades periapicales por su capacidad de apoptosis y piroptosis a las células.
(3,5-7)
Partiendo de que, la eliminación de los microorganismos y la prevención de la reinfección
dentro del conducto radicular es el principal objetivo del tratamiento endodóntico.
(8,9)
En enfer-
medades pulpares severas, la razón primordial del fracaso de un tratamiento de conducto está
dada por que los microrganismos no son erradicados totalmente; tal como ocurre en la necrosis
pulpar debido a un estado de putrefacción del nervio por la presencia de gran cantidad de microorga-
nismos, sin que exista antibacterianos de amplio potencial de eliminación o limpieza deficiente.
(10-12)
Los desechos producidos por Enterococcus faecalis constituyen un factor etiológico de las
enfermedades pulpares, especialmente de la necrosis pulpar. La principal causa de retratamiento
es la eliminación incompleta de ese tejido contenido en un complejo sistema de conductos,
quedando presentes microorganismos en la porción apical de la raíz fundamentalmente.
(1,13,14)
La
obturación inadecuada da la oportunidad a estos microorganismos para que colonicen estas
zonas y sobreviva a los materiales medicamentosos y obtenga alimento.
(9,13)
La presencia de este microorganismo no se manifiesta únicamente en los fallos de tratamientos
endodónticos, En algunos estudios, se ha encontrado en raíces del 70% de los casos de obtura-
ción por periodontitis apical.
(12)
Enterococcus faecalis estuvo presente en el 60% de tratamientos
endodónticos fallidos y en un 25% de piezas dentales sometidas al tratamiento. Se ha observado
que la bacteria tiene la capacidad degradativa similar a la esterasa, pudiendo afectar los compo-
nentes de la resina ocasionando la contaminación de la pieza dental.
(4,15,16)
El Hidróxido de Calcio constituye la sustancia antibacteriana más utilizada en el tratamiento
endodóntico,
(4,7)
debido a que su alto pH destruye la membrana celular bacteriana y las estructu-
ras de proteínas;
(17)
sin embargo, varios estudios demuestran que Enterococcus faecalis puede
ser resistente a varios antibacterianos incluyendo ese medicamento.
(1,4,18)
La eliminación de este
microrganismo por medios convencionales puede llegar a ser poco eficaz, haciéndose necesaria
la investigación de nuevos fármacos que potencien la acción de este o como alternativa terapéutica.
Así, el objetivo de la presente investigación fue evaluar la susceptibilidad in vitro del Enterococ-
cus faecalis ATCC- 29212 frente a la combinación de diferentes sustancias y medicamentos
antimicrobianos (propilenglicol, paramonoclorofenol, ampicilina + gentamicina + propilengli-
col) con Hidróxido de Calcio.
MATERIAL Y MÉTODOS
El presente estudio corresponde a una investigación aplicada, descriptiva transversal y experi-
mental que se desarrolló en el Laboratorio de Microbiología de la Universidad Nacional de
Chimborazo, durante los meses de junio y julio de 2019, cuyo procedimiento metodológico se
describe a continuación.
La actividad antibacteriana se realizó mediante el método de difusión en agar
Los estudios de la actividad antimicrobiana se llevaron a cabo utilizando la técnica de Kirby
Bauer
(19)
mediante el siguiente procedimiento:
1. Se preparó una combinación de diferentes sustancias y medicamentos antimicrobianos
(propilenglicol, paramonoclorofenol, ampicilina + gentamicina + propilenglicol) con
Hidróxido de Calcio a los que se les denominó Tratamientos (T) quedando conformados
de la manera siguiente: T1:Hidróxido de Calcio + propilenglicol, T2: Hidróxido de
Calcio + paramonoclorofenol, T3: Hidróxido de Calcio + ampicilina gentamicina +
propilenglicol, T4: Hidróxido de Calcio + suero fisiológico, el Control positivo fue una
pasta comercial a base de Hidróxido de Calcio.
2. Se utilizó una cepa bacteriana de Enterococcus faecalis ATCC- 29212 que provenía de
un cultivo fresco y puro, obtenido en agar.
3. Del cultivo fresco se preparó un inóculo bacteriano de 1,5 x 108 UFC/mL a partir de la
cepa bacteriana estudiada, el crecimiento bacteriano se ajustó a la turbidez del patrón 0.5
de McFarland.
(20)
4. La muestra bacteriana se obtuvo con un hisopo de algodón estéril introducido dentro del
tubo que contenía el inóculo estandarizado en el paso anterior. El exceso de líquido se
eliminó haciendo rotar suavemente el hisopo contra las paredes del tubo.
5. Con el hisopo debidamente humedecido, se inoculó en tres o cuatro direcciones toda la
superficie de una placa con agar Cerebro Corazón (BHI) girando sucesivamente dicha
placa en ángulos de 90º. Se dejó secar el inóculo a temperatura ambiente durante unos
minutos.
6. La evaluación de la actividad antibacteriana se realizó por triplicado, por lo tanto, en
series de 3 cajas de Petri se colocó con una pinza estéril en forma equidistante sobre la
superficie del agar en cada placa dos discos de papel filtro con 1µl de cada uno de los
tratamientos: T1, T2, T3, T4 y control positivo.
7. Se incubaron las placas en una estufa de cultivo a una temperatura de 35 ºC, en atmósfera
aeróbica.
8. La lectura de las placas se realizó después de 24 horas de incubación, la aparición de
halos de inhibición del crecimiento bacteriano alrededor de los discos permitió determi-
nar la actividad antimicrobiana, se midió el diámetro de los halos de inhibición y se reali-
zó la comparación de los mismos con la escala de Duraffourd,(21) siendo nula (menor o
igual a 8 mm), sensible (de 9 a 14 mm), muy sensible (de 15 a 19 mm) y sumamente
sensible (igual o superior a 20 mm).
Los datos obtenidos fueron procesados empleando el programa en SPSS Statistics 21.0, se reali-
zó un análisis de varianza para comparar múltiples medias ANOVA y método de Tukey para
crear intervalos de confianza en subconjuntos homogéneos, lo que permitió ejecutar compara-
ciones de medias entre los tratamientos (medicamentos combinados con Hidróxido de Calcio) y
elegir al tratamiento con mayor susceptibilidad frente a Enterococcus faecalis cepa
ATCC-29212.
Los investigadores utilizaron las instalaciones de laboratorio certificadas de la Universidad
Nacional de Chimborazo, siguiendo el protocolo establecido de bioseguridad para este tipo de
trabajo. El estudio contó con la aprobación de las comisiones a nivel de las respectivas carrera y
facultad.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Los resultados del estudio in vitro de la actividad antibacteriana de los cuatro tratamientos
propuestos (T1, T2, T3 y T4) y del control positivo (Hidróxido de Calcio pasta) sobre la especie
bacteriana: Enterococcus faecalis ATCC- 29212, permitió establecer la sensibilidad de esa
bacteria ante estos.
Aunque se observó sensibilidad ante cada sustancia utilizada, el tratamiento 3 (T3), empleando
Hidróxido de Calcio + ampicilina gentamicina + propilenglicol, arrojó los resultados más favo-
rables en la terapéutica antibacteriana dirigida al Enterococcus faecalis ATCC- 29212, microor-
ganismo que resultó sumamente sensible (X =22.5 mm) ante ese fármaco según la escala de
Duraffourd
(21)
(tabla 1).
Tabla 1. Sensibilidad de las combinaciones de medicamentos
El análisis de varianza de los valores medios de los halos de inhibición obtenidos al tratar in
vitro a la bacteria estudiada mediante diferentes combinaciones de tratamientos, obteniéndose
un valor de probabilidad significativo (0,002), lo que permite inferir que al menos uno de los
tratamientos comparados fue diferente (tabla 2).
Tabla 2. Análisis de varianza de las medias de los tratamientos
La prueba de Tukey de igualdad de medias de los grupos en subgrupos homogéneos permitió
identificar que el tratamiento 3 (T3) consigue que el diámetro medio de los halos de inhibición
se maximice (tabla 3).
Tabla 3. Igualdad de medias de Tukey
Los resultados de esta investigación concuerdan con los obtenidos en otros estudios,
(22,23,24,25)
en
los que se refiere la existencia de variaciones relativas a la resistencias, intrínsecas o adquiridas
por la bacteria Enterococcus faecalis. La terapia estándar está dada por el uso de ampicilina más
un aminoglucósido, de conjunto esas sustancias permiten un efecto sinérgico que incrementa la
actividad bactericida de los antibióticos.
Gavaldá et al.
(26)
reportan que el tratamiento experimental de la endocarditis resultó ser efectivo
mediante la combinación de ampicilina y gentamicina, con el objetivo de reforzar la acción de
la primera utilizándola de conjunto con otra que inhiba la síntesis de la pared celular del
microorganismo patógeno. Al respecto, también se sugiere el uso de una cefalosporina como la
ceftriaxona cuando existe resistencia adquirida de alto nivel a la gentamicina, anulando la siner-
gia de la unión antibiótica. Esos autores recomiendan la utilización de la combinación de ampi-
cilina más ceftriaxona por ser esta menos nefrotóxica en pacientes con problemas renales.
De acuerdo con el estudio realizado por Causse et al.,
(27)
El Enterococcus faecalis resulta más
sensible ante los betalactámicos como la ampicilina y la amoxicilina más ácido clavulánico, con
un 98% y 99% respectivamente; seguido de los aminoglucósidos como la gentamicina(76%), la
que causó mayor efecto en comparación con la estreptomicina (56%), lo que permite suponer la
existencia de un efecto sinérgico realizar terapia combinada mediante ampicilina y gentamicina,
coincidiendo con los resultados de la presente investigación. El tiempo estimado para que un
medicamento intraconducto cumpla su función oscila entre el tercer día y el séptimo día en
dependencia de la magnitud de la infección, la resistencia bacteriana y la respuesta del organis-
mo del paciente.
CONCLUSIONES
La evaluación in vitro permitió establecer que el tratamiento T3(Hidróxido de calcio + ampicili-
na, gentamicina y propilenglicol) resultó el más efectivo para inhibir al Enterococcus faecalis
cepa ATCC-29212, pudiendo potenciarse su acción a mayor tiempo de exposición. Lo que indica
que constituye una excelente alternativa farmacológica viable en intervenciones intraconducto,
ante una posible resistencia microbiana para evitar fracasos terapéuticos endodónticos.
Conflicto de intereses: los autores declaran no tener
Declaración de contribuciones:
Doménica Mishelly Rodríguez Robalino, Silvia Alexandra Reinoso Ortiz, Silvia Verónica Valle-
jo Lara, Paola Natalí Paredes Chinizaca, trabajaron en el desarrollo del proyecto, análisis micro-
biológico, recogida e interpretación de datos y la elaboración del artículo.
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Recibido: 2 de mayo de 2020
Aprobado: 11 de noviembre de 2020
12
cc
BY
NC
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Doménica Mishelly Rodríguez Robalino1 – https://orcid.org/00000002-0261-4909
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utilizó la técnica de difusión en agar, inoculando el microorganismo en cajas de Petri con agar
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miento por triplicado; T1 (Hidróxido de Calcio + propilenglicol), T2 (Hidróxido de Calcio +
paramonoclorofenol), T3 (Hidróxido de Calcio + ampicilina gentamicina + propilenglicol), T4
(Hidróxido de Calcio + Solución Salina Fisiológica), Control positivo (medicamento comercial a
base de Hidróxido de Calcio), se incubó a 35°C durante 24h, los halos formados alrededor de
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ANOVA de un factor. Se obtuvo una medida del halo de inhibición de 22,50±3,3 mm, con el trata-
miento T3, siendo sumamente sensible. Concluyendo que este resultó el más efectivo en compa-
ración el resto de la pruebas in vitro en comparación con el resto de los fármaco investigados.
Palabras clave: Enterococcus faecalis, hidróxido de calcio, ampicilina, gentamicina.
ABSTRACT
The high incidence of Enterococcus faecalis in dental procedures is a topic of interest for the
health area. This bacterium resists various antimicrobials and its proliferation increases due to
its low susceptibility to substances of conventional use such as calcium hydroxide, becoming a
of the main causes of root canal failure. The present investigation evaluated the in vitro suscepti-
bility of Enterococcus faecalis strain ATCC-29212 to the combination of substances and antibio-
tics with calcium hydroxide. The agar diffusion technique was used, inoculating the microorga-
nism in Petri dishes with Brain Heart agar (BHI), treated with filter paper disks impregnated
with 1µl of each treatment in triplicate; T1 (Calcium Hydroxide + propylene glycol), T2 (Cal-
cium Hydroxide + paramonochlorophenol), T3 (Calcium Hydroxide + ampicillin gentamicin +
propylene glycol), T4 (Calcium Hydroxide + Physiological Saline Solution), Positive control
(Hydroxide-based commercial medicine Calcium), incubated at 35 ° C for 24h, the halos formed
around each disc were measured and compared with the Duraffourd scale and processed by
one-factor ANOVA. A measure of the inhibition halo of 22.50 ± 3.3 mm was obtained with the
T3 treatment, being extremely sensitive. It was concluded that this was the most effective in
comparison with the rest of the in vitro tests of the rest of the investigated drugs.
Keywords: Enterococcus Faecalis, Calcium Hydroxide, Ampicillin, Gentamicin.
INTRODUCCIÓN
Enterococcus faecalis es un microorganismo anaerobio facultativo, Gram positivo, inmóvil, no
esporulado que coloniza el tracto gastrointestinal y forma parte de la microbiota normal de la
saliva.
(1,2)
Sin embargo, con la aparición de la terapia antibiótica, se ha convertido en un patóge-
no oportunista resistente que puede permanecer dentro de los conductos radiculares incluso
después de la instrumentación endodóntica,
(3,4)
siendo una de las principales causas del fracaso
en el tratamiento de conducto, debido a que componentes estructurales como el colágeno y la
fibronectina ayudan a la adhesión de la bacteria en tejidos y dentina. También favorece la apari-
ción de enfermedades periapicales por su capacidad de apoptosis y piroptosis a las células.
(3,5-7)
Partiendo de que, la eliminación de los microorganismos y la prevención de la reinfección
dentro del conducto radicular es el principal objetivo del tratamiento endodóntico.
(8,9)
En enfer-
medades pulpares severas, la razón primordial del fracaso de un tratamiento de conducto está
dada por que los microrganismos no son erradicados totalmente; tal como ocurre en la necrosis
pulpar debido a un estado de putrefacción del nervio por la presencia de gran cantidad de microorga-
nismos, sin que exista antibacterianos de amplio potencial de eliminación o limpieza deficiente.
(10-12)
Los desechos producidos por Enterococcus faecalis constituyen un factor etiológico de las
enfermedades pulpares, especialmente de la necrosis pulpar. La principal causa de retratamiento
es la eliminación incompleta de ese tejido contenido en un complejo sistema de conductos,
quedando presentes microorganismos en la porción apical de la raíz fundamentalmente.
(1,13,14)
La
obturación inadecuada da la oportunidad a estos microorganismos para que colonicen estas
zonas y sobreviva a los materiales medicamentosos y obtenga alimento.
(9,13)
La presencia de este microorganismo no se manifiesta únicamente en los fallos de tratamientos
endodónticos, En algunos estudios, se ha encontrado en raíces del 70% de los casos de obtura-
ción por periodontitis apical.
(12)
Enterococcus faecalis estuvo presente en el 60% de tratamientos
endodónticos fallidos y en un 25% de piezas dentales sometidas al tratamiento. Se ha observado
que la bacteria tiene la capacidad degradativa similar a la esterasa, pudiendo afectar los compo-
nentes de la resina ocasionando la contaminación de la pieza dental.
(4,15,16)
El Hidróxido de Calcio constituye la sustancia antibacteriana más utilizada en el tratamiento
endodóntico,
(4,7)
debido a que su alto pH destruye la membrana celular bacteriana y las estructu-
ras de proteínas;
(17)
sin embargo, varios estudios demuestran que Enterococcus faecalis puede
ser resistente a varios antibacterianos incluyendo ese medicamento.
(1,4,18)
La eliminación de este
microrganismo por medios convencionales puede llegar a ser poco eficaz, haciéndose necesaria
la investigación de nuevos fármacos que potencien la acción de este o como alternativa terapéutica.
Así, el objetivo de la presente investigación fue evaluar la susceptibilidad in vitro del Enterococ-
cus faecalis ATCC- 29212 frente a la combinación de diferentes sustancias y medicamentos
antimicrobianos (propilenglicol, paramonoclorofenol, ampicilina + gentamicina + propilengli-
col) con Hidróxido de Calcio.
MATERIAL Y MÉTODOS
El presente estudio corresponde a una investigación aplicada, descriptiva transversal y experi-
mental que se desarrolló en el Laboratorio de Microbiología de la Universidad Nacional de
Chimborazo, durante los meses de junio y julio de 2019, cuyo procedimiento metodológico se
describe a continuación.
La actividad antibacteriana se realizó mediante el método de difusión en agar
Los estudios de la actividad antimicrobiana se llevaron a cabo utilizando la técnica de Kirby
Bauer
(19)
mediante el siguiente procedimiento:
1. Se preparó una combinación de diferentes sustancias y medicamentos antimicrobianos
(propilenglicol, paramonoclorofenol, ampicilina + gentamicina + propilenglicol) con
Hidróxido de Calcio a los que se les denominó Tratamientos (T) quedando conformados
de la manera siguiente: T1:Hidróxido de Calcio + propilenglicol, T2: Hidróxido de
Calcio + paramonoclorofenol, T3: Hidróxido de Calcio + ampicilina gentamicina +
propilenglicol, T4: Hidróxido de Calcio + suero fisiológico, el Control positivo fue una
pasta comercial a base de Hidróxido de Calcio.
2. Se utilizó una cepa bacteriana de Enterococcus faecalis ATCC- 29212 que provenía de
un cultivo fresco y puro, obtenido en agar.
3. Del cultivo fresco se preparó un inóculo bacteriano de 1,5 x 108 UFC/mL a partir de la
cepa bacteriana estudiada, el crecimiento bacteriano se ajustó a la turbidez del patrón 0.5
de McFarland.
(20)
4. La muestra bacteriana se obtuvo con un hisopo de algodón estéril introducido dentro del
tubo que contenía el inóculo estandarizado en el paso anterior. El exceso de líquido se
eliminó haciendo rotar suavemente el hisopo contra las paredes del tubo.
5. Con el hisopo debidamente humedecido, se inoculó en tres o cuatro direcciones toda la
superficie de una placa con agar Cerebro Corazón (BHI) girando sucesivamente dicha
placa en ángulos de 90º. Se dejó secar el inóculo a temperatura ambiente durante unos
minutos.
6. La evaluación de la actividad antibacteriana se realizó por triplicado, por lo tanto, en
series de 3 cajas de Petri se colocó con una pinza estéril en forma equidistante sobre la
superficie del agar en cada placa dos discos de papel filtro con 1µl de cada uno de los
tratamientos: T1, T2, T3, T4 y control positivo.
7. Se incubaron las placas en una estufa de cultivo a una temperatura de 35 ºC, en atmósfera
aeróbica.
8. La lectura de las placas se realizó después de 24 horas de incubación, la aparición de
halos de inhibición del crecimiento bacteriano alrededor de los discos permitió determi-
nar la actividad antimicrobiana, se midió el diámetro de los halos de inhibición y se reali-
zó la comparación de los mismos con la escala de Duraffourd,(21) siendo nula (menor o
igual a 8 mm), sensible (de 9 a 14 mm), muy sensible (de 15 a 19 mm) y sumamente
sensible (igual o superior a 20 mm).
Los datos obtenidos fueron procesados empleando el programa en SPSS Statistics 21.0, se reali-
zó un análisis de varianza para comparar múltiples medias ANOVA y método de Tukey para
crear intervalos de confianza en subconjuntos homogéneos, lo que permitió ejecutar compara-
ciones de medias entre los tratamientos (medicamentos combinados con Hidróxido de Calcio) y
elegir al tratamiento con mayor susceptibilidad frente a Enterococcus faecalis cepa
ATCC-29212.
Los investigadores utilizaron las instalaciones de laboratorio certificadas de la Universidad
Nacional de Chimborazo, siguiendo el protocolo establecido de bioseguridad para este tipo de
trabajo. El estudio contó con la aprobación de las comisiones a nivel de las respectivas carrera y
facultad.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Los resultados del estudio in vitro de la actividad antibacteriana de los cuatro tratamientos
propuestos (T1, T2, T3 y T4) y del control positivo (Hidróxido de Calcio pasta) sobre la especie
bacteriana: Enterococcus faecalis ATCC- 29212, permitió establecer la sensibilidad de esa
bacteria ante estos.
Aunque se observó sensibilidad ante cada sustancia utilizada, el tratamiento 3 (T3), empleando
Hidróxido de Calcio + ampicilina gentamicina + propilenglicol, arrojó los resultados más favo-
rables en la terapéutica antibacteriana dirigida al Enterococcus faecalis ATCC- 29212, microor-
ganismo que resultó sumamente sensible (X =22.5 mm) ante ese fármaco según la escala de
Duraffourd
(21)
(tabla 1).
Tabla 1. Sensibilidad de las combinaciones de medicamentos
El análisis de varianza de los valores medios de los halos de inhibición obtenidos al tratar in
vitro a la bacteria estudiada mediante diferentes combinaciones de tratamientos, obteniéndose
un valor de probabilidad significativo (0,002), lo que permite inferir que al menos uno de los
tratamientos comparados fue diferente (tabla 2).
Tabla 2. Análisis de varianza de las medias de los tratamientos
La prueba de Tukey de igualdad de medias de los grupos en subgrupos homogéneos permitió
identificar que el tratamiento 3 (T3) consigue que el diámetro medio de los halos de inhibición
se maximice (tabla 3).
Tabla 3. Igualdad de medias de Tukey
Los resultados de esta investigación concuerdan con los obtenidos en otros estudios,
(22,23,24,25)
en
los que se refiere la existencia de variaciones relativas a la resistencias, intrínsecas o adquiridas
por la bacteria Enterococcus faecalis. La terapia estándar está dada por el uso de ampicilina más
un aminoglucósido, de conjunto esas sustancias permiten un efecto sinérgico que incrementa la
actividad bactericida de los antibióticos.
Gavaldá et al.
(26)
reportan que el tratamiento experimental de la endocarditis resultó ser efectivo
mediante la combinación de ampicilina y gentamicina, con el objetivo de reforzar la acción de
la primera utilizándola de conjunto con otra que inhiba la síntesis de la pared celular del
microorganismo patógeno. Al respecto, también se sugiere el uso de una cefalosporina como la
ceftriaxona cuando existe resistencia adquirida de alto nivel a la gentamicina, anulando la siner-
gia de la unión antibiótica. Esos autores recomiendan la utilización de la combinación de ampi-
cilina más ceftriaxona por ser esta menos nefrotóxica en pacientes con problemas renales.
De acuerdo con el estudio realizado por Causse et al.,
(27)
El Enterococcus faecalis resulta más
sensible ante los betalactámicos como la ampicilina y la amoxicilina más ácido clavulánico, con
un 98% y 99% respectivamente; seguido de los aminoglucósidos como la gentamicina(76%), la
que causó mayor efecto en comparación con la estreptomicina (56%), lo que permite suponer la
existencia de un efecto sinérgico realizar terapia combinada mediante ampicilina y gentamicina,
coincidiendo con los resultados de la presente investigación. El tiempo estimado para que un
medicamento intraconducto cumpla su función oscila entre el tercer día y el séptimo día en
dependencia de la magnitud de la infección, la resistencia bacteriana y la respuesta del organis-
mo del paciente.
CONCLUSIONES
La evaluación in vitro permitió establecer que el tratamiento T3(Hidróxido de calcio + ampicili-
na, gentamicina y propilenglicol) resultó el más efectivo para inhibir al Enterococcus faecalis
cepa ATCC-29212, pudiendo potenciarse su acción a mayor tiempo de exposición. Lo que indica
que constituye una excelente alternativa farmacológica viable en intervenciones intraconducto,
ante una posible resistencia microbiana para evitar fracasos terapéuticos endodónticos.
Conflicto de intereses: los autores declaran no tener
Declaración de contribuciones:
Doménica Mishelly Rodríguez Robalino, Silvia Alexandra Reinoso Ortiz, Silvia Verónica Valle-
jo Lara, Paola Natalí Paredes Chinizaca, trabajaron en el desarrollo del proyecto, análisis micro-
biológico, recogida e interpretación de datos y la elaboración del artículo.
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Recibido: 2 de mayo de 2020
Aprobado: 11 de noviembre de 2020
13
cc
BY
NC
ND
REE Volumen 15(1) Riobamba ene. - abr. 2021
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
ISSN-impreso 1390-7581
ISSN-digital 2661-6742
Evaluación de la susceptibilidad de Enterococcus faecalis ATCC-29212 frente a medica-
mentos combinados con hidróxido de calcio
Evaluation of the susceptibility of Enterococcus faecalis ATCC-29212 to drugs combined
with calcium hydroxide
https://doi.org/10.37135/ee.04.10.02
Autores:
Doménica Mishelly Rodríguez Robalino1 – https://orcid.org/00000002-0261-4909
Silvia Alexandra Reinoso Ortiz2 – https://orcid.org/00000002-8895-8947
Silvia Verónica Vallejo Lara2 – https://orcid.org/00000001-9857-4157
Paola Natali Paredes Chinizaca2– https://orcid.org/0000-0003-0453-7019
1Centro de Salud Tipo B Guano, Guano, Ecuador
2Universidad Nacional de Chimborazo, Riobamba, Ecuador
Autor de correspondencia: Silvia Alexandra Reinoso Ortiz. Universidad Nacional de Chimbo-
razo. Av. Antonio José de Sucre, Via a Guano. Riobamba, Chimborazo Ecuador. Teléfono:
0998285461. Email: sreinoso@unach.edu.ec
RESUMEN
La elevada incidencia del Enterococcus faecalis en procedimientos odontológicos es un tópico de
interés para el área de la salud, esta bacteria resiste a varios antimicrobianos y su proliferación
aumenta debido a su baja susceptibilidad a sustancias de uso convencional como el hidróxido de
calcio, convirtiéndose en una de las principales causas del fracaso de los tratamientos de conduc-
to. La presente investigación evaluó la susceptibilidad in vitro del Enterococcus faecalis cepa
ATCC-29212 frente a la combinación de sustancias y antibióticos con el hidróxido de calcio. Se
utilizó la técnica de difusión en agar, inoculando el microorganismo en cajas de Petri con agar
Cerebro Corazón (BHI), tratado con discos de papel filtro impregnados con 1µl de cada trata-
miento por triplicado; T1 (Hidróxido de Calcio + propilenglicol), T2 (Hidróxido de Calcio +
paramonoclorofenol), T3 (Hidróxido de Calcio + ampicilina gentamicina + propilenglicol), T4
(Hidróxido de Calcio + Solución Salina Fisiológica), Control positivo (medicamento comercial a
base de Hidróxido de Calcio), se incubó a 35°C durante 24h, los halos formados alrededor de
cada disco fueron medidos y comparados con la escala de Duraffourd y procesados mediante
ANOVA de un factor. Se obtuvo una medida del halo de inhibición de 22,50±3,3 mm, con el trata-
miento T3, siendo sumamente sensible. Concluyendo que este resultó el más efectivo en compa-
ración el resto de la pruebas in vitro en comparación con el resto de los fármaco investigados.
Palabras clave: Enterococcus faecalis, hidróxido de calcio, ampicilina, gentamicina.
ABSTRACT
The high incidence of Enterococcus faecalis in dental procedures is a topic of interest for the
health area. This bacterium resists various antimicrobials and its proliferation increases due to
its low susceptibility to substances of conventional use such as calcium hydroxide, becoming a
of the main causes of root canal failure. The present investigation evaluated the in vitro suscepti-
bility of Enterococcus faecalis strain ATCC-29212 to the combination of substances and antibio-
tics with calcium hydroxide. The agar diffusion technique was used, inoculating the microorga-
nism in Petri dishes with Brain Heart agar (BHI), treated with filter paper disks impregnated
with 1µl of each treatment in triplicate; T1 (Calcium Hydroxide + propylene glycol), T2 (Cal-
cium Hydroxide + paramonochlorophenol), T3 (Calcium Hydroxide + ampicillin gentamicin +
propylene glycol), T4 (Calcium Hydroxide + Physiological Saline Solution), Positive control
(Hydroxide-based commercial medicine Calcium), incubated at 35 ° C for 24h, the halos formed
around each disc were measured and compared with the Duraffourd scale and processed by
one-factor ANOVA. A measure of the inhibition halo of 22.50 ± 3.3 mm was obtained with the
T3 treatment, being extremely sensitive. It was concluded that this was the most effective in
comparison with the rest of the in vitro tests of the rest of the investigated drugs.
Keywords: Enterococcus Faecalis, Calcium Hydroxide, Ampicillin, Gentamicin.
INTRODUCCIÓN
Enterococcus faecalis es un microorganismo anaerobio facultativo, Gram positivo, inmóvil, no
esporulado que coloniza el tracto gastrointestinal y forma parte de la microbiota normal de la
saliva.
(1,2)
Sin embargo, con la aparición de la terapia antibiótica, se ha convertido en un patóge-
no oportunista resistente que puede permanecer dentro de los conductos radiculares incluso
después de la instrumentación endodóntica,
(3,4)
siendo una de las principales causas del fracaso
en el tratamiento de conducto, debido a que componentes estructurales como el colágeno y la
fibronectina ayudan a la adhesión de la bacteria en tejidos y dentina. También favorece la apari-
ción de enfermedades periapicales por su capacidad de apoptosis y piroptosis a las células.
(3,5-7)
Partiendo de que, la eliminación de los microorganismos y la prevención de la reinfección
dentro del conducto radicular es el principal objetivo del tratamiento endodóntico.
(8,9)
En enfer-
medades pulpares severas, la razón primordial del fracaso de un tratamiento de conducto está
dada por que los microrganismos no son erradicados totalmente; tal como ocurre en la necrosis
pulpar debido a un estado de putrefacción del nervio por la presencia de gran cantidad de microorga-
nismos, sin que exista antibacterianos de amplio potencial de eliminación o limpieza deficiente.
(10-12)
Los desechos producidos por Enterococcus faecalis constituyen un factor etiológico de las
enfermedades pulpares, especialmente de la necrosis pulpar. La principal causa de retratamiento
es la eliminación incompleta de ese tejido contenido en un complejo sistema de conductos,
quedando presentes microorganismos en la porción apical de la raíz fundamentalmente.
(1,13,14)
La
obturación inadecuada da la oportunidad a estos microorganismos para que colonicen estas
zonas y sobreviva a los materiales medicamentosos y obtenga alimento.
(9,13)
La presencia de este microorganismo no se manifiesta únicamente en los fallos de tratamientos
endodónticos, En algunos estudios, se ha encontrado en raíces del 70% de los casos de obtura-
ción por periodontitis apical.
(12)
Enterococcus faecalis estuvo presente en el 60% de tratamientos
endodónticos fallidos y en un 25% de piezas dentales sometidas al tratamiento. Se ha observado
que la bacteria tiene la capacidad degradativa similar a la esterasa, pudiendo afectar los compo-
nentes de la resina ocasionando la contaminación de la pieza dental.
(4,15,16)
El Hidróxido de Calcio constituye la sustancia antibacteriana más utilizada en el tratamiento
endodóntico,
(4,7)
debido a que su alto pH destruye la membrana celular bacteriana y las estructu-
ras de proteínas;
(17)
sin embargo, varios estudios demuestran que Enterococcus faecalis puede
ser resistente a varios antibacterianos incluyendo ese medicamento.
(1,4,18)
La eliminación de este
microrganismo por medios convencionales puede llegar a ser poco eficaz, haciéndose necesaria
la investigación de nuevos fármacos que potencien la acción de este o como alternativa terapéutica.
Así, el objetivo de la presente investigación fue evaluar la susceptibilidad in vitro del Enterococ-
cus faecalis ATCC- 29212 frente a la combinación de diferentes sustancias y medicamentos
antimicrobianos (propilenglicol, paramonoclorofenol, ampicilina + gentamicina + propilengli-
col) con Hidróxido de Calcio.
MATERIAL Y MÉTODOS
El presente estudio corresponde a una investigación aplicada, descriptiva transversal y experi-
mental que se desarrolló en el Laboratorio de Microbiología de la Universidad Nacional de
Chimborazo, durante los meses de junio y julio de 2019, cuyo procedimiento metodológico se
describe a continuación.
La actividad antibacteriana se realizó mediante el método de difusión en agar
Los estudios de la actividad antimicrobiana se llevaron a cabo utilizando la técnica de Kirby
Bauer
(19)
mediante el siguiente procedimiento:
1. Se preparó una combinación de diferentes sustancias y medicamentos antimicrobianos
(propilenglicol, paramonoclorofenol, ampicilina + gentamicina + propilenglicol) con
Hidróxido de Calcio a los que se les denominó Tratamientos (T) quedando conformados
de la manera siguiente: T1:Hidróxido de Calcio + propilenglicol, T2: Hidróxido de
Calcio + paramonoclorofenol, T3: Hidróxido de Calcio + ampicilina gentamicina +
propilenglicol, T4: Hidróxido de Calcio + suero fisiológico, el Control positivo fue una
pasta comercial a base de Hidróxido de Calcio.
2. Se utilizó una cepa bacteriana de Enterococcus faecalis ATCC- 29212 que provenía de
un cultivo fresco y puro, obtenido en agar.
3. Del cultivo fresco se preparó un inóculo bacteriano de 1,5 x 108 UFC/mL a partir de la
cepa bacteriana estudiada, el crecimiento bacteriano se ajustó a la turbidez del patrón 0.5
de McFarland.
(20)
4. La muestra bacteriana se obtuvo con un hisopo de algodón estéril introducido dentro del
tubo que contenía el inóculo estandarizado en el paso anterior. El exceso de líquido se
eliminó haciendo rotar suavemente el hisopo contra las paredes del tubo.
5. Con el hisopo debidamente humedecido, se inoculó en tres o cuatro direcciones toda la
superficie de una placa con agar Cerebro Corazón (BHI) girando sucesivamente dicha
placa en ángulos de 90º. Se dejó secar el inóculo a temperatura ambiente durante unos
minutos.
6. La evaluación de la actividad antibacteriana se realizó por triplicado, por lo tanto, en
series de 3 cajas de Petri se colocó con una pinza estéril en forma equidistante sobre la
superficie del agar en cada placa dos discos de papel filtro con 1µl de cada uno de los
tratamientos: T1, T2, T3, T4 y control positivo.
7. Se incubaron las placas en una estufa de cultivo a una temperatura de 35 ºC, en atmósfera
aeróbica.
8. La lectura de las placas se realizó después de 24 horas de incubación, la aparición de
halos de inhibición del crecimiento bacteriano alrededor de los discos permitió determi-
nar la actividad antimicrobiana, se midió el diámetro de los halos de inhibición y se reali-
zó la comparación de los mismos con la escala de Duraffourd,(21) siendo nula (menor o
igual a 8 mm), sensible (de 9 a 14 mm), muy sensible (de 15 a 19 mm) y sumamente
sensible (igual o superior a 20 mm).
Los datos obtenidos fueron procesados empleando el programa en SPSS Statistics 21.0, se reali-
zó un análisis de varianza para comparar múltiples medias ANOVA y método de Tukey para
crear intervalos de confianza en subconjuntos homogéneos, lo que permitió ejecutar compara-
ciones de medias entre los tratamientos (medicamentos combinados con Hidróxido de Calcio) y
elegir al tratamiento con mayor susceptibilidad frente a Enterococcus faecalis cepa
ATCC-29212.
Los investigadores utilizaron las instalaciones de laboratorio certificadas de la Universidad
Nacional de Chimborazo, siguiendo el protocolo establecido de bioseguridad para este tipo de
trabajo. El estudio contó con la aprobación de las comisiones a nivel de las respectivas carrera y
facultad.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Los resultados del estudio in vitro de la actividad antibacteriana de los cuatro tratamientos
propuestos (T1, T2, T3 y T4) y del control positivo (Hidróxido de Calcio pasta) sobre la especie
bacteriana: Enterococcus faecalis ATCC- 29212, permitió establecer la sensibilidad de esa
bacteria ante estos.
Aunque se observó sensibilidad ante cada sustancia utilizada, el tratamiento 3 (T3), empleando
Hidróxido de Calcio + ampicilina gentamicina + propilenglicol, arrojó los resultados más favo-
rables en la terapéutica antibacteriana dirigida al Enterococcus faecalis ATCC- 29212, microor-
ganismo que resultó sumamente sensible (X =22.5 mm) ante ese fármaco según la escala de
Duraffourd
(21)
(tabla 1).
Tabla 1. Sensibilidad de las combinaciones de medicamentos
El análisis de varianza de los valores medios de los halos de inhibición obtenidos al tratar in
vitro a la bacteria estudiada mediante diferentes combinaciones de tratamientos, obteniéndose
un valor de probabilidad significativo (0,002), lo que permite inferir que al menos uno de los
tratamientos comparados fue diferente (tabla 2).
Tabla 2. Análisis de varianza de las medias de los tratamientos
La prueba de Tukey de igualdad de medias de los grupos en subgrupos homogéneos permitió
identificar que el tratamiento 3 (T3) consigue que el diámetro medio de los halos de inhibición
se maximice (tabla 3).
Tabla 3. Igualdad de medias de Tukey
Los resultados de esta investigación concuerdan con los obtenidos en otros estudios,
(22,23,24,25)
en
los que se refiere la existencia de variaciones relativas a la resistencias, intrínsecas o adquiridas
por la bacteria Enterococcus faecalis. La terapia estándar está dada por el uso de ampicilina más
un aminoglucósido, de conjunto esas sustancias permiten un efecto sinérgico que incrementa la
actividad bactericida de los antibióticos.
Gavaldá et al.
(26)
reportan que el tratamiento experimental de la endocarditis resultó ser efectivo
mediante la combinación de ampicilina y gentamicina, con el objetivo de reforzar la acción de
la primera utilizándola de conjunto con otra que inhiba la síntesis de la pared celular del
microorganismo patógeno. Al respecto, también se sugiere el uso de una cefalosporina como la
ceftriaxona cuando existe resistencia adquirida de alto nivel a la gentamicina, anulando la siner-
gia de la unión antibiótica. Esos autores recomiendan la utilización de la combinación de ampi-
cilina más ceftriaxona por ser esta menos nefrotóxica en pacientes con problemas renales.
De acuerdo con el estudio realizado por Causse et al.,
(27)
El Enterococcus faecalis resulta más
sensible ante los betalactámicos como la ampicilina y la amoxicilina más ácido clavulánico, con
un 98% y 99% respectivamente; seguido de los aminoglucósidos como la gentamicina(76%), la
que causó mayor efecto en comparación con la estreptomicina (56%), lo que permite suponer la
existencia de un efecto sinérgico realizar terapia combinada mediante ampicilina y gentamicina,
coincidiendo con los resultados de la presente investigación. El tiempo estimado para que un
medicamento intraconducto cumpla su función oscila entre el tercer día y el séptimo día en
dependencia de la magnitud de la infección, la resistencia bacteriana y la respuesta del organis-
mo del paciente.
CONCLUSIONES
La evaluación in vitro permitió establecer que el tratamiento T3(Hidróxido de calcio + ampicili-
na, gentamicina y propilenglicol) resultó el más efectivo para inhibir al Enterococcus faecalis
cepa ATCC-29212, pudiendo potenciarse su acción a mayor tiempo de exposición. Lo que indica
que constituye una excelente alternativa farmacológica viable en intervenciones intraconducto,
ante una posible resistencia microbiana para evitar fracasos terapéuticos endodónticos.
Conflicto de intereses: los autores declaran no tener
Declaración de contribuciones:
Doménica Mishelly Rodríguez Robalino, Silvia Alexandra Reinoso Ortiz, Silvia Verónica Valle-
jo Lara, Paola Natalí Paredes Chinizaca, trabajaron en el desarrollo del proyecto, análisis micro-
biológico, recogida e interpretación de datos y la elaboración del artículo.
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Recibido: 2 de mayo de 2020
Aprobado: 11 de noviembre de 2020
14
cc
BY
NC
ND
REE Volumen 15(1) Riobamba ene. - abr. 2021
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
ISSN-impreso 1390-7581
ISSN-digital 2661-6742
Evaluación de la susceptibilidad de Enterococcus faecalis ATCC-29212 frente a medica-
mentos combinados con hidróxido de calcio
Evaluation of the susceptibility of Enterococcus faecalis ATCC-29212 to drugs combined
with calcium hydroxide
https://doi.org/10.37135/ee.04.10.02
Autores:
Doménica Mishelly Rodríguez Robalino1 – https://orcid.org/00000002-0261-4909
Silvia Alexandra Reinoso Ortiz2 – https://orcid.org/00000002-8895-8947
Silvia Verónica Vallejo Lara2 – https://orcid.org/00000001-9857-4157
Paola Natali Paredes Chinizaca2– https://orcid.org/0000-0003-0453-7019
1Centro de Salud Tipo B Guano, Guano, Ecuador
2Universidad Nacional de Chimborazo, Riobamba, Ecuador
Autor de correspondencia: Silvia Alexandra Reinoso Ortiz. Universidad Nacional de Chimbo-
razo. Av. Antonio José de Sucre, Via a Guano. Riobamba, Chimborazo Ecuador. Teléfono:
0998285461. Email: sreinoso@unach.edu.ec
RESUMEN
La elevada incidencia del Enterococcus faecalis en procedimientos odontológicos es un tópico de
interés para el área de la salud, esta bacteria resiste a varios antimicrobianos y su proliferación
aumenta debido a su baja susceptibilidad a sustancias de uso convencional como el hidróxido de
calcio, convirtiéndose en una de las principales causas del fracaso de los tratamientos de conduc-
to. La presente investigación evaluó la susceptibilidad in vitro del Enterococcus faecalis cepa
ATCC-29212 frente a la combinación de sustancias y antibióticos con el hidróxido de calcio. Se
utilizó la técnica de difusión en agar, inoculando el microorganismo en cajas de Petri con agar
Cerebro Corazón (BHI), tratado con discos de papel filtro impregnados con 1µl de cada trata-
miento por triplicado; T1 (Hidróxido de Calcio + propilenglicol), T2 (Hidróxido de Calcio +
paramonoclorofenol), T3 (Hidróxido de Calcio + ampicilina gentamicina + propilenglicol), T4
(Hidróxido de Calcio + Solución Salina Fisiológica), Control positivo (medicamento comercial a
base de Hidróxido de Calcio), se incubó a 35°C durante 24h, los halos formados alrededor de
cada disco fueron medidos y comparados con la escala de Duraffourd y procesados mediante
ANOVA de un factor. Se obtuvo una medida del halo de inhibición de 22,50±3,3 mm, con el trata-
miento T3, siendo sumamente sensible. Concluyendo que este resultó el más efectivo en compa-
ración el resto de la pruebas in vitro en comparación con el resto de los fármaco investigados.
Palabras clave: Enterococcus faecalis, hidróxido de calcio, ampicilina, gentamicina.
ABSTRACT
The high incidence of Enterococcus faecalis in dental procedures is a topic of interest for the
health area. This bacterium resists various antimicrobials and its proliferation increases due to
its low susceptibility to substances of conventional use such as calcium hydroxide, becoming a
of the main causes of root canal failure. The present investigation evaluated the in vitro suscepti-
bility of Enterococcus faecalis strain ATCC-29212 to the combination of substances and antibio-
tics with calcium hydroxide. The agar diffusion technique was used, inoculating the microorga-
nism in Petri dishes with Brain Heart agar (BHI), treated with filter paper disks impregnated
with 1µl of each treatment in triplicate; T1 (Calcium Hydroxide + propylene glycol), T2 (Cal-
cium Hydroxide + paramonochlorophenol), T3 (Calcium Hydroxide + ampicillin gentamicin +
propylene glycol), T4 (Calcium Hydroxide + Physiological Saline Solution), Positive control
(Hydroxide-based commercial medicine Calcium), incubated at 35 ° C for 24h, the halos formed
around each disc were measured and compared with the Duraffourd scale and processed by
one-factor ANOVA. A measure of the inhibition halo of 22.50 ± 3.3 mm was obtained with the
T3 treatment, being extremely sensitive. It was concluded that this was the most effective in
comparison with the rest of the in vitro tests of the rest of the investigated drugs.
Keywords: Enterococcus Faecalis, Calcium Hydroxide, Ampicillin, Gentamicin.
INTRODUCCIÓN
Enterococcus faecalis es un microorganismo anaerobio facultativo, Gram positivo, inmóvil, no
esporulado que coloniza el tracto gastrointestinal y forma parte de la microbiota normal de la
saliva.
(1,2)
Sin embargo, con la aparición de la terapia antibiótica, se ha convertido en un patóge-
no oportunista resistente que puede permanecer dentro de los conductos radiculares incluso
después de la instrumentación endodóntica,
(3,4)
siendo una de las principales causas del fracaso
en el tratamiento de conducto, debido a que componentes estructurales como el colágeno y la
fibronectina ayudan a la adhesión de la bacteria en tejidos y dentina. También favorece la apari-
ción de enfermedades periapicales por su capacidad de apoptosis y piroptosis a las células.
(3,5-7)
Partiendo de que, la eliminación de los microorganismos y la prevención de la reinfección
dentro del conducto radicular es el principal objetivo del tratamiento endodóntico.
(8,9)
En enfer-
medades pulpares severas, la razón primordial del fracaso de un tratamiento de conducto está
dada por que los microrganismos no son erradicados totalmente; tal como ocurre en la necrosis
pulpar debido a un estado de putrefacción del nervio por la presencia de gran cantidad de microorga-
nismos, sin que exista antibacterianos de amplio potencial de eliminación o limpieza deficiente.
(10-12)
Los desechos producidos por Enterococcus faecalis constituyen un factor etiológico de las
enfermedades pulpares, especialmente de la necrosis pulpar. La principal causa de retratamiento
es la eliminación incompleta de ese tejido contenido en un complejo sistema de conductos,
quedando presentes microorganismos en la porción apical de la raíz fundamentalmente.
(1,13,14)
La
obturación inadecuada da la oportunidad a estos microorganismos para que colonicen estas
zonas y sobreviva a los materiales medicamentosos y obtenga alimento.
(9,13)
La presencia de este microorganismo no se manifiesta únicamente en los fallos de tratamientos
endodónticos, En algunos estudios, se ha encontrado en raíces del 70% de los casos de obtura-
ción por periodontitis apical.
(12)
Enterococcus faecalis estuvo presente en el 60% de tratamientos
endodónticos fallidos y en un 25% de piezas dentales sometidas al tratamiento. Se ha observado
que la bacteria tiene la capacidad degradativa similar a la esterasa, pudiendo afectar los compo-
nentes de la resina ocasionando la contaminación de la pieza dental.
(4,15,16)
El Hidróxido de Calcio constituye la sustancia antibacteriana más utilizada en el tratamiento
endodóntico,
(4,7)
debido a que su alto pH destruye la membrana celular bacteriana y las estructu-
ras de proteínas;
(17)
sin embargo, varios estudios demuestran que Enterococcus faecalis puede
ser resistente a varios antibacterianos incluyendo ese medicamento.
(1,4,18)
La eliminación de este
microrganismo por medios convencionales puede llegar a ser poco eficaz, haciéndose necesaria
la investigación de nuevos fármacos que potencien la acción de este o como alternativa terapéutica.
Así, el objetivo de la presente investigación fue evaluar la susceptibilidad in vitro del Enterococ-
cus faecalis ATCC- 29212 frente a la combinación de diferentes sustancias y medicamentos
antimicrobianos (propilenglicol, paramonoclorofenol, ampicilina + gentamicina + propilengli-
col) con Hidróxido de Calcio.
MATERIAL Y MÉTODOS
El presente estudio corresponde a una investigación aplicada, descriptiva transversal y experi-
mental que se desarrolló en el Laboratorio de Microbiología de la Universidad Nacional de
Chimborazo, durante los meses de junio y julio de 2019, cuyo procedimiento metodológico se
describe a continuación.
La actividad antibacteriana se realizó mediante el método de difusión en agar
Los estudios de la actividad antimicrobiana se llevaron a cabo utilizando la técnica de Kirby
Bauer
(19)
mediante el siguiente procedimiento:
1. Se preparó una combinación de diferentes sustancias y medicamentos antimicrobianos
(propilenglicol, paramonoclorofenol, ampicilina + gentamicina + propilenglicol) con
Hidróxido de Calcio a los que se les denominó Tratamientos (T) quedando conformados
de la manera siguiente: T1:Hidróxido de Calcio + propilenglicol, T2: Hidróxido de
Calcio + paramonoclorofenol, T3: Hidróxido de Calcio + ampicilina gentamicina +
propilenglicol, T4: Hidróxido de Calcio + suero fisiológico, el Control positivo fue una
pasta comercial a base de Hidróxido de Calcio.
2. Se utilizó una cepa bacteriana de Enterococcus faecalis ATCC- 29212 que provenía de
un cultivo fresco y puro, obtenido en agar.
3. Del cultivo fresco se preparó un inóculo bacteriano de 1,5 x 108 UFC/mL a partir de la
cepa bacteriana estudiada, el crecimiento bacteriano se ajustó a la turbidez del patrón 0.5
de McFarland.
(20)
4. La muestra bacteriana se obtuvo con un hisopo de algodón estéril introducido dentro del
tubo que contenía el inóculo estandarizado en el paso anterior. El exceso de líquido se
eliminó haciendo rotar suavemente el hisopo contra las paredes del tubo.
5. Con el hisopo debidamente humedecido, se inoculó en tres o cuatro direcciones toda la
superficie de una placa con agar Cerebro Corazón (BHI) girando sucesivamente dicha
placa en ángulos de 90º. Se dejó secar el inóculo a temperatura ambiente durante unos
minutos.
6. La evaluación de la actividad antibacteriana se realizó por triplicado, por lo tanto, en
series de 3 cajas de Petri se colocó con una pinza estéril en forma equidistante sobre la
superficie del agar en cada placa dos discos de papel filtro con 1µl de cada uno de los
tratamientos: T1, T2, T3, T4 y control positivo.
7. Se incubaron las placas en una estufa de cultivo a una temperatura de 35 ºC, en atmósfera
aeróbica.
8. La lectura de las placas se realizó después de 24 horas de incubación, la aparición de
halos de inhibición del crecimiento bacteriano alrededor de los discos permitió determi-
nar la actividad antimicrobiana, se midió el diámetro de los halos de inhibición y se reali-
zó la comparación de los mismos con la escala de Duraffourd,(21) siendo nula (menor o
igual a 8 mm), sensible (de 9 a 14 mm), muy sensible (de 15 a 19 mm) y sumamente
sensible (igual o superior a 20 mm).
Los datos obtenidos fueron procesados empleando el programa en SPSS Statistics 21.0, se reali-
zó un análisis de varianza para comparar múltiples medias ANOVA y método de Tukey para
crear intervalos de confianza en subconjuntos homogéneos, lo que permitió ejecutar compara-
ciones de medias entre los tratamientos (medicamentos combinados con Hidróxido de Calcio) y
elegir al tratamiento con mayor susceptibilidad frente a Enterococcus faecalis cepa
ATCC-29212.
Los investigadores utilizaron las instalaciones de laboratorio certificadas de la Universidad
Nacional de Chimborazo, siguiendo el protocolo establecido de bioseguridad para este tipo de
trabajo. El estudio contó con la aprobación de las comisiones a nivel de las respectivas carrera y
facultad.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Los resultados del estudio in vitro de la actividad antibacteriana de los cuatro tratamientos
propuestos (T1, T2, T3 y T4) y del control positivo (Hidróxido de Calcio pasta) sobre la especie
bacteriana: Enterococcus faecalis ATCC- 29212, permitió establecer la sensibilidad de esa
bacteria ante estos.
Aunque se observó sensibilidad ante cada sustancia utilizada, el tratamiento 3 (T3), empleando
Hidróxido de Calcio + ampicilina gentamicina + propilenglicol, arrojó los resultados más favo-
rables en la terapéutica antibacteriana dirigida al Enterococcus faecalis ATCC- 29212, microor-
ganismo que resultó sumamente sensible (X =22.5 mm) ante ese fármaco según la escala de
Duraffourd
(21)
(tabla 1).
Tabla 1. Sensibilidad de las combinaciones de medicamentos
El análisis de varianza de los valores medios de los halos de inhibición obtenidos al tratar in
vitro a la bacteria estudiada mediante diferentes combinaciones de tratamientos, obteniéndose
un valor de probabilidad significativo (0,002), lo que permite inferir que al menos uno de los
tratamientos comparados fue diferente (tabla 2).
Tabla 2. Análisis de varianza de las medias de los tratamientos
La prueba de Tukey de igualdad de medias de los grupos en subgrupos homogéneos permitió
identificar que el tratamiento 3 (T3) consigue que el diámetro medio de los halos de inhibición
se maximice (tabla 3).
Tabla 3. Igualdad de medias de Tukey
Los resultados de esta investigación concuerdan con los obtenidos en otros estudios,
(22,23,24,25)
en
los que se refiere la existencia de variaciones relativas a la resistencias, intrínsecas o adquiridas
por la bacteria Enterococcus faecalis. La terapia estándar está dada por el uso de ampicilina más
un aminoglucósido, de conjunto esas sustancias permiten un efecto sinérgico que incrementa la
actividad bactericida de los antibióticos.
Gavaldá et al.
(26)
reportan que el tratamiento experimental de la endocarditis resultó ser efectivo
mediante la combinación de ampicilina y gentamicina, con el objetivo de reforzar la acción de
la primera utilizándola de conjunto con otra que inhiba la síntesis de la pared celular del
microorganismo patógeno. Al respecto, también se sugiere el uso de una cefalosporina como la
ceftriaxona cuando existe resistencia adquirida de alto nivel a la gentamicina, anulando la siner-
gia de la unión antibiótica. Esos autores recomiendan la utilización de la combinación de ampi-
cilina más ceftriaxona por ser esta menos nefrotóxica en pacientes con problemas renales.
De acuerdo con el estudio realizado por Causse et al.,
(27)
El Enterococcus faecalis resulta más
sensible ante los betalactámicos como la ampicilina y la amoxicilina más ácido clavulánico, con
un 98% y 99% respectivamente; seguido de los aminoglucósidos como la gentamicina(76%), la
que causó mayor efecto en comparación con la estreptomicina (56%), lo que permite suponer la
existencia de un efecto sinérgico realizar terapia combinada mediante ampicilina y gentamicina,
coincidiendo con los resultados de la presente investigación. El tiempo estimado para que un
medicamento intraconducto cumpla su función oscila entre el tercer día y el séptimo día en
dependencia de la magnitud de la infección, la resistencia bacteriana y la respuesta del organis-
mo del paciente.
CONCLUSIONES
La evaluación in vitro permitió establecer que el tratamiento T3(Hidróxido de calcio + ampicili-
na, gentamicina y propilenglicol) resultó el más efectivo para inhibir al Enterococcus faecalis
cepa ATCC-29212, pudiendo potenciarse su acción a mayor tiempo de exposición. Lo que indica
que constituye una excelente alternativa farmacológica viable en intervenciones intraconducto,
ante una posible resistencia microbiana para evitar fracasos terapéuticos endodónticos.
Conflicto de intereses: los autores declaran no tener
Declaración de contribuciones:
Doménica Mishelly Rodríguez Robalino, Silvia Alexandra Reinoso Ortiz, Silvia Verónica Valle-
jo Lara, Paola Natalí Paredes Chinizaca, trabajaron en el desarrollo del proyecto, análisis micro-
biológico, recogida e interpretación de datos y la elaboración del artículo.
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Recibido: 2 de mayo de 2020
Aprobado: 11 de noviembre de 2020
15
cc
BY
NC
ND
REE Volumen 15(1) Riobamba ene. - abr. 2021
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
ISSN-impreso 1390-7581
ISSN-digital 2661-6742
Evaluación de la susceptibilidad de Enterococcus faecalis ATCC-29212 frente a medica-
mentos combinados con hidróxido de calcio
Evaluation of the susceptibility of Enterococcus faecalis ATCC-29212 to drugs combined
with calcium hydroxide
https://doi.org/10.37135/ee.04.10.02
Autores:
Doménica Mishelly Rodríguez Robalino1 – https://orcid.org/00000002-0261-4909
Silvia Alexandra Reinoso Ortiz2 – https://orcid.org/00000002-8895-8947
Silvia Verónica Vallejo Lara2 – https://orcid.org/00000001-9857-4157
Paola Natali Paredes Chinizaca2– https://orcid.org/0000-0003-0453-7019
1Centro de Salud Tipo B Guano, Guano, Ecuador
2Universidad Nacional de Chimborazo, Riobamba, Ecuador
Autor de correspondencia: Silvia Alexandra Reinoso Ortiz. Universidad Nacional de Chimbo-
razo. Av. Antonio José de Sucre, Via a Guano. Riobamba, Chimborazo Ecuador. Teléfono:
0998285461. Email: sreinoso@unach.edu.ec
RESUMEN
La elevada incidencia del Enterococcus faecalis en procedimientos odontológicos es un tópico de
interés para el área de la salud, esta bacteria resiste a varios antimicrobianos y su proliferación
aumenta debido a su baja susceptibilidad a sustancias de uso convencional como el hidróxido de
calcio, convirtiéndose en una de las principales causas del fracaso de los tratamientos de conduc-
to. La presente investigación evaluó la susceptibilidad in vitro del Enterococcus faecalis cepa
ATCC-29212 frente a la combinación de sustancias y antibióticos con el hidróxido de calcio. Se
utilizó la técnica de difusión en agar, inoculando el microorganismo en cajas de Petri con agar
Cerebro Corazón (BHI), tratado con discos de papel filtro impregnados con 1µl de cada trata-
miento por triplicado; T1 (Hidróxido de Calcio + propilenglicol), T2 (Hidróxido de Calcio +
paramonoclorofenol), T3 (Hidróxido de Calcio + ampicilina gentamicina + propilenglicol), T4
(Hidróxido de Calcio + Solución Salina Fisiológica), Control positivo (medicamento comercial a
base de Hidróxido de Calcio), se incubó a 35°C durante 24h, los halos formados alrededor de
cada disco fueron medidos y comparados con la escala de Duraffourd y procesados mediante
ANOVA de un factor. Se obtuvo una medida del halo de inhibición de 22,50±3,3 mm, con el trata-
miento T3, siendo sumamente sensible. Concluyendo que este resultó el más efectivo en compa-
ración el resto de la pruebas in vitro en comparación con el resto de los fármaco investigados.
Palabras clave: Enterococcus faecalis, hidróxido de calcio, ampicilina, gentamicina.
ABSTRACT
The high incidence of Enterococcus faecalis in dental procedures is a topic of interest for the
health area. This bacterium resists various antimicrobials and its proliferation increases due to
its low susceptibility to substances of conventional use such as calcium hydroxide, becoming a
of the main causes of root canal failure. The present investigation evaluated the in vitro suscepti-
bility of Enterococcus faecalis strain ATCC-29212 to the combination of substances and antibio-
tics with calcium hydroxide. The agar diffusion technique was used, inoculating the microorga-
nism in Petri dishes with Brain Heart agar (BHI), treated with filter paper disks impregnated
with 1µl of each treatment in triplicate; T1 (Calcium Hydroxide + propylene glycol), T2 (Cal-
cium Hydroxide + paramonochlorophenol), T3 (Calcium Hydroxide + ampicillin gentamicin +
propylene glycol), T4 (Calcium Hydroxide + Physiological Saline Solution), Positive control
(Hydroxide-based commercial medicine Calcium), incubated at 35 ° C for 24h, the halos formed
around each disc were measured and compared with the Duraffourd scale and processed by
one-factor ANOVA. A measure of the inhibition halo of 22.50 ± 3.3 mm was obtained with the
T3 treatment, being extremely sensitive. It was concluded that this was the most effective in
comparison with the rest of the in vitro tests of the rest of the investigated drugs.
Keywords: Enterococcus Faecalis, Calcium Hydroxide, Ampicillin, Gentamicin.
INTRODUCCIÓN
Enterococcus faecalis es un microorganismo anaerobio facultativo, Gram positivo, inmóvil, no
esporulado que coloniza el tracto gastrointestinal y forma parte de la microbiota normal de la
saliva.
(1,2)
Sin embargo, con la aparición de la terapia antibiótica, se ha convertido en un patóge-
no oportunista resistente que puede permanecer dentro de los conductos radiculares incluso
después de la instrumentación endodóntica,
(3,4)
siendo una de las principales causas del fracaso
en el tratamiento de conducto, debido a que componentes estructurales como el colágeno y la
fibronectina ayudan a la adhesión de la bacteria en tejidos y dentina. También favorece la apari-
ción de enfermedades periapicales por su capacidad de apoptosis y piroptosis a las células.
(3,5-7)
Partiendo de que, la eliminación de los microorganismos y la prevención de la reinfección
dentro del conducto radicular es el principal objetivo del tratamiento endodóntico.
(8,9)
En enfer-
medades pulpares severas, la razón primordial del fracaso de un tratamiento de conducto está
dada por que los microrganismos no son erradicados totalmente; tal como ocurre en la necrosis
pulpar debido a un estado de putrefacción del nervio por la presencia de gran cantidad de microorga-
nismos, sin que exista antibacterianos de amplio potencial de eliminación o limpieza deficiente.
(10-12)
Los desechos producidos por Enterococcus faecalis constituyen un factor etiológico de las
enfermedades pulpares, especialmente de la necrosis pulpar. La principal causa de retratamiento
es la eliminación incompleta de ese tejido contenido en un complejo sistema de conductos,
quedando presentes microorganismos en la porción apical de la raíz fundamentalmente.
(1,13,14)
La
obturación inadecuada da la oportunidad a estos microorganismos para que colonicen estas
zonas y sobreviva a los materiales medicamentosos y obtenga alimento.
(9,13)
La presencia de este microorganismo no se manifiesta únicamente en los fallos de tratamientos
endodónticos, En algunos estudios, se ha encontrado en raíces del 70% de los casos de obtura-
ción por periodontitis apical.
(12)
Enterococcus faecalis estuvo presente en el 60% de tratamientos
endodónticos fallidos y en un 25% de piezas dentales sometidas al tratamiento. Se ha observado
que la bacteria tiene la capacidad degradativa similar a la esterasa, pudiendo afectar los compo-
nentes de la resina ocasionando la contaminación de la pieza dental.
(4,15,16)
El Hidróxido de Calcio constituye la sustancia antibacteriana más utilizada en el tratamiento
endodóntico,
(4,7)
debido a que su alto pH destruye la membrana celular bacteriana y las estructu-
ras de proteínas;
(17)
sin embargo, varios estudios demuestran que Enterococcus faecalis puede
ser resistente a varios antibacterianos incluyendo ese medicamento.
(1,4,18)
La eliminación de este
microrganismo por medios convencionales puede llegar a ser poco eficaz, haciéndose necesaria
la investigación de nuevos fármacos que potencien la acción de este o como alternativa terapéutica.
Así, el objetivo de la presente investigación fue evaluar la susceptibilidad in vitro del Enterococ-
cus faecalis ATCC- 29212 frente a la combinación de diferentes sustancias y medicamentos
antimicrobianos (propilenglicol, paramonoclorofenol, ampicilina + gentamicina + propilengli-
col) con Hidróxido de Calcio.
MATERIAL Y MÉTODOS
El presente estudio corresponde a una investigación aplicada, descriptiva transversal y experi-
mental que se desarrolló en el Laboratorio de Microbiología de la Universidad Nacional de
Chimborazo, durante los meses de junio y julio de 2019, cuyo procedimiento metodológico se
describe a continuación.
La actividad antibacteriana se realizó mediante el método de difusión en agar
Los estudios de la actividad antimicrobiana se llevaron a cabo utilizando la técnica de Kirby
Bauer
(19)
mediante el siguiente procedimiento:
1. Se preparó una combinación de diferentes sustancias y medicamentos antimicrobianos
(propilenglicol, paramonoclorofenol, ampicilina + gentamicina + propilenglicol) con
Hidróxido de Calcio a los que se les denominó Tratamientos (T) quedando conformados
de la manera siguiente: T1:Hidróxido de Calcio + propilenglicol, T2: Hidróxido de
Calcio + paramonoclorofenol, T3: Hidróxido de Calcio + ampicilina gentamicina +
propilenglicol, T4: Hidróxido de Calcio + suero fisiológico, el Control positivo fue una
pasta comercial a base de Hidróxido de Calcio.
2. Se utilizó una cepa bacteriana de Enterococcus faecalis ATCC- 29212 que provenía de
un cultivo fresco y puro, obtenido en agar.
3. Del cultivo fresco se preparó un inóculo bacteriano de 1,5 x 108 UFC/mL a partir de la
cepa bacteriana estudiada, el crecimiento bacteriano se ajustó a la turbidez del patrón 0.5
de McFarland.
(20)
4. La muestra bacteriana se obtuvo con un hisopo de algodón estéril introducido dentro del
tubo que contenía el inóculo estandarizado en el paso anterior. El exceso de líquido se
eliminó haciendo rotar suavemente el hisopo contra las paredes del tubo.
5. Con el hisopo debidamente humedecido, se inoculó en tres o cuatro direcciones toda la
superficie de una placa con agar Cerebro Corazón (BHI) girando sucesivamente dicha
placa en ángulos de 90º. Se dejó secar el inóculo a temperatura ambiente durante unos
minutos.
6. La evaluación de la actividad antibacteriana se realizó por triplicado, por lo tanto, en
series de 3 cajas de Petri se colocó con una pinza estéril en forma equidistante sobre la
superficie del agar en cada placa dos discos de papel filtro con 1µl de cada uno de los
tratamientos: T1, T2, T3, T4 y control positivo.
7. Se incubaron las placas en una estufa de cultivo a una temperatura de 35 ºC, en atmósfera
aeróbica.
8. La lectura de las placas se realizó después de 24 horas de incubación, la aparición de
halos de inhibición del crecimiento bacteriano alrededor de los discos permitió determi-
nar la actividad antimicrobiana, se midió el diámetro de los halos de inhibición y se reali-
zó la comparación de los mismos con la escala de Duraffourd,(21) siendo nula (menor o
igual a 8 mm), sensible (de 9 a 14 mm), muy sensible (de 15 a 19 mm) y sumamente
sensible (igual o superior a 20 mm).
Los datos obtenidos fueron procesados empleando el programa en SPSS Statistics 21.0, se reali-
zó un análisis de varianza para comparar múltiples medias ANOVA y método de Tukey para
crear intervalos de confianza en subconjuntos homogéneos, lo que permitió ejecutar compara-
ciones de medias entre los tratamientos (medicamentos combinados con Hidróxido de Calcio) y
elegir al tratamiento con mayor susceptibilidad frente a Enterococcus faecalis cepa
ATCC-29212.
Los investigadores utilizaron las instalaciones de laboratorio certificadas de la Universidad
Nacional de Chimborazo, siguiendo el protocolo establecido de bioseguridad para este tipo de
trabajo. El estudio contó con la aprobación de las comisiones a nivel de las respectivas carrera y
facultad.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Los resultados del estudio in vitro de la actividad antibacteriana de los cuatro tratamientos
propuestos (T1, T2, T3 y T4) y del control positivo (Hidróxido de Calcio pasta) sobre la especie
bacteriana: Enterococcus faecalis ATCC- 29212, permitió establecer la sensibilidad de esa
bacteria ante estos.
Aunque se observó sensibilidad ante cada sustancia utilizada, el tratamiento 3 (T3), empleando
Hidróxido de Calcio + ampicilina gentamicina + propilenglicol, arrojó los resultados más favo-
rables en la terapéutica antibacteriana dirigida al Enterococcus faecalis ATCC- 29212, microor-
ganismo que resultó sumamente sensible (X =22.5 mm) ante ese fármaco según la escala de
Duraffourd
(21)
(tabla 1).
Tabla 1. Sensibilidad de las combinaciones de medicamentos
El análisis de varianza de los valores medios de los halos de inhibición obtenidos al tratar in
vitro a la bacteria estudiada mediante diferentes combinaciones de tratamientos, obteniéndose
un valor de probabilidad significativo (0,002), lo que permite inferir que al menos uno de los
tratamientos comparados fue diferente (tabla 2).
Tabla 2. Análisis de varianza de las medias de los tratamientos
La prueba de Tukey de igualdad de medias de los grupos en subgrupos homogéneos permitió
identificar que el tratamiento 3 (T3) consigue que el diámetro medio de los halos de inhibición
se maximice (tabla 3).
Tabla 3. Igualdad de medias de Tukey
Los resultados de esta investigación concuerdan con los obtenidos en otros estudios,
(22,23,24,25)
en
los que se refiere la existencia de variaciones relativas a la resistencias, intrínsecas o adquiridas
por la bacteria Enterococcus faecalis. La terapia estándar está dada por el uso de ampicilina más
un aminoglucósido, de conjunto esas sustancias permiten un efecto sinérgico que incrementa la
actividad bactericida de los antibióticos.
Gavaldá et al.
(26)
reportan que el tratamiento experimental de la endocarditis resultó ser efectivo
mediante la combinación de ampicilina y gentamicina, con el objetivo de reforzar la acción de
la primera utilizándola de conjunto con otra que inhiba la síntesis de la pared celular del
microorganismo patógeno. Al respecto, también se sugiere el uso de una cefalosporina como la
ceftriaxona cuando existe resistencia adquirida de alto nivel a la gentamicina, anulando la siner-
gia de la unión antibiótica. Esos autores recomiendan la utilización de la combinación de ampi-
cilina más ceftriaxona por ser esta menos nefrotóxica en pacientes con problemas renales.
De acuerdo con el estudio realizado por Causse et al.,
(27)
El Enterococcus faecalis resulta más
sensible ante los betalactámicos como la ampicilina y la amoxicilina más ácido clavulánico, con
un 98% y 99% respectivamente; seguido de los aminoglucósidos como la gentamicina(76%), la
que causó mayor efecto en comparación con la estreptomicina (56%), lo que permite suponer la
existencia de un efecto sinérgico realizar terapia combinada mediante ampicilina y gentamicina,
coincidiendo con los resultados de la presente investigación. El tiempo estimado para que un
medicamento intraconducto cumpla su función oscila entre el tercer día y el séptimo día en
dependencia de la magnitud de la infección, la resistencia bacteriana y la respuesta del organis-
mo del paciente.
CONCLUSIONES
La evaluación in vitro permitió establecer que el tratamiento T3(Hidróxido de calcio + ampicili-
na, gentamicina y propilenglicol) resultó el más efectivo para inhibir al Enterococcus faecalis
cepa ATCC-29212, pudiendo potenciarse su acción a mayor tiempo de exposición. Lo que indica
que constituye una excelente alternativa farmacológica viable en intervenciones intraconducto,
ante una posible resistencia microbiana para evitar fracasos terapéuticos endodónticos.
Conflicto de intereses: los autores declaran no tener
Declaración de contribuciones:
Doménica Mishelly Rodríguez Robalino, Silvia Alexandra Reinoso Ortiz, Silvia Verónica Valle-
jo Lara, Paola Natalí Paredes Chinizaca, trabajaron en el desarrollo del proyecto, análisis micro-
biológico, recogida e interpretación de datos y la elaboración del artículo.
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Recibido: 2 de mayo de 2020
Aprobado: 11 de noviembre de 2020
16
cc
BY
NC
ND
REE Volumen 15(1) Riobamba ene. - abr. 2021
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
ISSN-impreso 1390-7581
ISSN-digital 2661-6742
Evaluación de la susceptibilidad de Enterococcus faecalis ATCC-29212 frente a medica-
mentos combinados con hidróxido de calcio
Evaluation of the susceptibility of Enterococcus faecalis ATCC-29212 to drugs combined
with calcium hydroxide
https://doi.org/10.37135/ee.04.10.02
Autores:
Doménica Mishelly Rodríguez Robalino1 – https://orcid.org/00000002-0261-4909
Silvia Alexandra Reinoso Ortiz2 – https://orcid.org/00000002-8895-8947
Silvia Verónica Vallejo Lara2 – https://orcid.org/00000001-9857-4157
Paola Natali Paredes Chinizaca2– https://orcid.org/0000-0003-0453-7019
1Centro de Salud Tipo B Guano, Guano, Ecuador
2Universidad Nacional de Chimborazo, Riobamba, Ecuador
Autor de correspondencia: Silvia Alexandra Reinoso Ortiz. Universidad Nacional de Chimbo-
razo. Av. Antonio José de Sucre, Via a Guano. Riobamba, Chimborazo Ecuador. Teléfono:
0998285461. Email: sreinoso@unach.edu.ec
RESUMEN
La elevada incidencia del Enterococcus faecalis en procedimientos odontológicos es un tópico de
interés para el área de la salud, esta bacteria resiste a varios antimicrobianos y su proliferación
aumenta debido a su baja susceptibilidad a sustancias de uso convencional como el hidróxido de
calcio, convirtiéndose en una de las principales causas del fracaso de los tratamientos de conduc-
to. La presente investigación evaluó la susceptibilidad in vitro del Enterococcus faecalis cepa
ATCC-29212 frente a la combinación de sustancias y antibióticos con el hidróxido de calcio. Se
utilizó la técnica de difusión en agar, inoculando el microorganismo en cajas de Petri con agar
Cerebro Corazón (BHI), tratado con discos de papel filtro impregnados con 1µl de cada trata-
miento por triplicado; T1 (Hidróxido de Calcio + propilenglicol), T2 (Hidróxido de Calcio +
paramonoclorofenol), T3 (Hidróxido de Calcio + ampicilina gentamicina + propilenglicol), T4
(Hidróxido de Calcio + Solución Salina Fisiológica), Control positivo (medicamento comercial a
base de Hidróxido de Calcio), se incubó a 35°C durante 24h, los halos formados alrededor de
cada disco fueron medidos y comparados con la escala de Duraffourd y procesados mediante
ANOVA de un factor. Se obtuvo una medida del halo de inhibición de 22,50±3,3 mm, con el trata-
miento T3, siendo sumamente sensible. Concluyendo que este resultó el más efectivo en compa-
ración el resto de la pruebas in vitro en comparación con el resto de los fármaco investigados.
Palabras clave: Enterococcus faecalis, hidróxido de calcio, ampicilina, gentamicina.
ABSTRACT
The high incidence of Enterococcus faecalis in dental procedures is a topic of interest for the
health area. This bacterium resists various antimicrobials and its proliferation increases due to
its low susceptibility to substances of conventional use such as calcium hydroxide, becoming a
of the main causes of root canal failure. The present investigation evaluated the in vitro suscepti-
bility of Enterococcus faecalis strain ATCC-29212 to the combination of substances and antibio-
tics with calcium hydroxide. The agar diffusion technique was used, inoculating the microorga-
nism in Petri dishes with Brain Heart agar (BHI), treated with filter paper disks impregnated
with 1µl of each treatment in triplicate; T1 (Calcium Hydroxide + propylene glycol), T2 (Cal-
cium Hydroxide + paramonochlorophenol), T3 (Calcium Hydroxide + ampicillin gentamicin +
propylene glycol), T4 (Calcium Hydroxide + Physiological Saline Solution), Positive control
(Hydroxide-based commercial medicine Calcium), incubated at 35 ° C for 24h, the halos formed
around each disc were measured and compared with the Duraffourd scale and processed by
one-factor ANOVA. A measure of the inhibition halo of 22.50 ± 3.3 mm was obtained with the
T3 treatment, being extremely sensitive. It was concluded that this was the most effective in
comparison with the rest of the in vitro tests of the rest of the investigated drugs.
Keywords: Enterococcus Faecalis, Calcium Hydroxide, Ampicillin, Gentamicin.
INTRODUCCIÓN
Enterococcus faecalis es un microorganismo anaerobio facultativo, Gram positivo, inmóvil, no
esporulado que coloniza el tracto gastrointestinal y forma parte de la microbiota normal de la
saliva.
(1,2)
Sin embargo, con la aparición de la terapia antibiótica, se ha convertido en un patóge-
no oportunista resistente que puede permanecer dentro de los conductos radiculares incluso
después de la instrumentación endodóntica,
(3,4)
siendo una de las principales causas del fracaso
en el tratamiento de conducto, debido a que componentes estructurales como el colágeno y la
fibronectina ayudan a la adhesión de la bacteria en tejidos y dentina. También favorece la apari-
ción de enfermedades periapicales por su capacidad de apoptosis y piroptosis a las células.
(3,5-7)
Partiendo de que, la eliminación de los microorganismos y la prevención de la reinfección
dentro del conducto radicular es el principal objetivo del tratamiento endodóntico.
(8,9)
En enfer-
medades pulpares severas, la razón primordial del fracaso de un tratamiento de conducto está
dada por que los microrganismos no son erradicados totalmente; tal como ocurre en la necrosis
pulpar debido a un estado de putrefacción del nervio por la presencia de gran cantidad de microorga-
nismos, sin que exista antibacterianos de amplio potencial de eliminación o limpieza deficiente.
(10-12)
Los desechos producidos por Enterococcus faecalis constituyen un factor etiológico de las
enfermedades pulpares, especialmente de la necrosis pulpar. La principal causa de retratamiento
es la eliminación incompleta de ese tejido contenido en un complejo sistema de conductos,
quedando presentes microorganismos en la porción apical de la raíz fundamentalmente.
(1,13,14)
La
obturación inadecuada da la oportunidad a estos microorganismos para que colonicen estas
zonas y sobreviva a los materiales medicamentosos y obtenga alimento.
(9,13)
La presencia de este microorganismo no se manifiesta únicamente en los fallos de tratamientos
endodónticos, En algunos estudios, se ha encontrado en raíces del 70% de los casos de obtura-
ción por periodontitis apical.
(12)
Enterococcus faecalis estuvo presente en el 60% de tratamientos
endodónticos fallidos y en un 25% de piezas dentales sometidas al tratamiento. Se ha observado
que la bacteria tiene la capacidad degradativa similar a la esterasa, pudiendo afectar los compo-
nentes de la resina ocasionando la contaminación de la pieza dental.
(4,15,16)
El Hidróxido de Calcio constituye la sustancia antibacteriana más utilizada en el tratamiento
endodóntico,
(4,7)
debido a que su alto pH destruye la membrana celular bacteriana y las estructu-
ras de proteínas;
(17)
sin embargo, varios estudios demuestran que Enterococcus faecalis puede
ser resistente a varios antibacterianos incluyendo ese medicamento.
(1,4,18)
La eliminación de este
microrganismo por medios convencionales puede llegar a ser poco eficaz, haciéndose necesaria
la investigación de nuevos fármacos que potencien la acción de este o como alternativa terapéutica.
Así, el objetivo de la presente investigación fue evaluar la susceptibilidad in vitro del Enterococ-
cus faecalis ATCC- 29212 frente a la combinación de diferentes sustancias y medicamentos
antimicrobianos (propilenglicol, paramonoclorofenol, ampicilina + gentamicina + propilengli-
col) con Hidróxido de Calcio.
MATERIAL Y MÉTODOS
El presente estudio corresponde a una investigación aplicada, descriptiva transversal y experi-
mental que se desarrolló en el Laboratorio de Microbiología de la Universidad Nacional de
Chimborazo, durante los meses de junio y julio de 2019, cuyo procedimiento metodológico se
describe a continuación.
La actividad antibacteriana se realizó mediante el método de difusión en agar
Los estudios de la actividad antimicrobiana se llevaron a cabo utilizando la técnica de Kirby
Bauer
(19)
mediante el siguiente procedimiento:
1. Se preparó una combinación de diferentes sustancias y medicamentos antimicrobianos
(propilenglicol, paramonoclorofenol, ampicilina + gentamicina + propilenglicol) con
Hidróxido de Calcio a los que se les denominó Tratamientos (T) quedando conformados
de la manera siguiente: T1:Hidróxido de Calcio + propilenglicol, T2: Hidróxido de
Calcio + paramonoclorofenol, T3: Hidróxido de Calcio + ampicilina gentamicina +
propilenglicol, T4: Hidróxido de Calcio + suero fisiológico, el Control positivo fue una
pasta comercial a base de Hidróxido de Calcio.
2. Se utilizó una cepa bacteriana de Enterococcus faecalis ATCC- 29212 que provenía de
un cultivo fresco y puro, obtenido en agar.
3. Del cultivo fresco se preparó un inóculo bacteriano de 1,5 x 108 UFC/mL a partir de la
cepa bacteriana estudiada, el crecimiento bacteriano se ajustó a la turbidez del patrón 0.5
de McFarland.
(20)
4. La muestra bacteriana se obtuvo con un hisopo de algodón estéril introducido dentro del
tubo que contenía el inóculo estandarizado en el paso anterior. El exceso de líquido se
eliminó haciendo rotar suavemente el hisopo contra las paredes del tubo.
5. Con el hisopo debidamente humedecido, se inoculó en tres o cuatro direcciones toda la
superficie de una placa con agar Cerebro Corazón (BHI) girando sucesivamente dicha
placa en ángulos de 90º. Se dejó secar el inóculo a temperatura ambiente durante unos
minutos.
6. La evaluación de la actividad antibacteriana se realizó por triplicado, por lo tanto, en
series de 3 cajas de Petri se colocó con una pinza estéril en forma equidistante sobre la
superficie del agar en cada placa dos discos de papel filtro con 1µl de cada uno de los
tratamientos: T1, T2, T3, T4 y control positivo.
7. Se incubaron las placas en una estufa de cultivo a una temperatura de 35 ºC, en atmósfera
aeróbica.
8. La lectura de las placas se realizó después de 24 horas de incubación, la aparición de
halos de inhibición del crecimiento bacteriano alrededor de los discos permitió determi-
nar la actividad antimicrobiana, se midió el diámetro de los halos de inhibición y se reali-
zó la comparación de los mismos con la escala de Duraffourd,(21) siendo nula (menor o
igual a 8 mm), sensible (de 9 a 14 mm), muy sensible (de 15 a 19 mm) y sumamente
sensible (igual o superior a 20 mm).
Los datos obtenidos fueron procesados empleando el programa en SPSS Statistics 21.0, se reali-
zó un análisis de varianza para comparar múltiples medias ANOVA y método de Tukey para
crear intervalos de confianza en subconjuntos homogéneos, lo que permitió ejecutar compara-
ciones de medias entre los tratamientos (medicamentos combinados con Hidróxido de Calcio) y
elegir al tratamiento con mayor susceptibilidad frente a Enterococcus faecalis cepa
ATCC-29212.
Los investigadores utilizaron las instalaciones de laboratorio certificadas de la Universidad
Nacional de Chimborazo, siguiendo el protocolo establecido de bioseguridad para este tipo de
trabajo. El estudio contó con la aprobación de las comisiones a nivel de las respectivas carrera y
facultad.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Los resultados del estudio in vitro de la actividad antibacteriana de los cuatro tratamientos
propuestos (T1, T2, T3 y T4) y del control positivo (Hidróxido de Calcio pasta) sobre la especie
bacteriana: Enterococcus faecalis ATCC- 29212, permitió establecer la sensibilidad de esa
bacteria ante estos.
Aunque se observó sensibilidad ante cada sustancia utilizada, el tratamiento 3 (T3), empleando
Hidróxido de Calcio + ampicilina gentamicina + propilenglicol, arrojó los resultados más favo-
rables en la terapéutica antibacteriana dirigida al Enterococcus faecalis ATCC- 29212, microor-
ganismo que resultó sumamente sensible (X =22.5 mm) ante ese fármaco según la escala de
Duraffourd
(21)
(tabla 1).
Tabla 1. Sensibilidad de las combinaciones de medicamentos
El análisis de varianza de los valores medios de los halos de inhibición obtenidos al tratar in
vitro a la bacteria estudiada mediante diferentes combinaciones de tratamientos, obteniéndose
un valor de probabilidad significativo (0,002), lo que permite inferir que al menos uno de los
tratamientos comparados fue diferente (tabla 2).
Tabla 2. Análisis de varianza de las medias de los tratamientos
La prueba de Tukey de igualdad de medias de los grupos en subgrupos homogéneos permitió
identificar que el tratamiento 3 (T3) consigue que el diámetro medio de los halos de inhibición
se maximice (tabla 3).
Tabla 3. Igualdad de medias de Tukey
Los resultados de esta investigación concuerdan con los obtenidos en otros estudios,
(22,23,24,25)
en
los que se refiere la existencia de variaciones relativas a la resistencias, intrínsecas o adquiridas
por la bacteria Enterococcus faecalis. La terapia estándar está dada por el uso de ampicilina más
un aminoglucósido, de conjunto esas sustancias permiten un efecto sinérgico que incrementa la
actividad bactericida de los antibióticos.
Gavaldá et al.
(26)
reportan que el tratamiento experimental de la endocarditis resultó ser efectivo
mediante la combinación de ampicilina y gentamicina, con el objetivo de reforzar la acción de
la primera utilizándola de conjunto con otra que inhiba la síntesis de la pared celular del
microorganismo patógeno. Al respecto, también se sugiere el uso de una cefalosporina como la
ceftriaxona cuando existe resistencia adquirida de alto nivel a la gentamicina, anulando la siner-
gia de la unión antibiótica. Esos autores recomiendan la utilización de la combinación de ampi-
cilina más ceftriaxona por ser esta menos nefrotóxica en pacientes con problemas renales.
De acuerdo con el estudio realizado por Causse et al.,
(27)
El Enterococcus faecalis resulta más
sensible ante los betalactámicos como la ampicilina y la amoxicilina más ácido clavulánico, con
un 98% y 99% respectivamente; seguido de los aminoglucósidos como la gentamicina(76%), la
que causó mayor efecto en comparación con la estreptomicina (56%), lo que permite suponer la
existencia de un efecto sinérgico realizar terapia combinada mediante ampicilina y gentamicina,
coincidiendo con los resultados de la presente investigación. El tiempo estimado para que un
medicamento intraconducto cumpla su función oscila entre el tercer día y el séptimo día en
dependencia de la magnitud de la infección, la resistencia bacteriana y la respuesta del organis-
mo del paciente.
CONCLUSIONES
La evaluación in vitro permitió establecer que el tratamiento T3(Hidróxido de calcio + ampicili-
na, gentamicina y propilenglicol) resultó el más efectivo para inhibir al Enterococcus faecalis
cepa ATCC-29212, pudiendo potenciarse su acción a mayor tiempo de exposición. Lo que indica
que constituye una excelente alternativa farmacológica viable en intervenciones intraconducto,
ante una posible resistencia microbiana para evitar fracasos terapéuticos endodónticos.
Conflicto de intereses: los autores declaran no tener
Declaración de contribuciones:
Doménica Mishelly Rodríguez Robalino, Silvia Alexandra Reinoso Ortiz, Silvia Verónica Valle-
jo Lara, Paola Natalí Paredes Chinizaca, trabajaron en el desarrollo del proyecto, análisis micro-
biológico, recogida e interpretación de datos y la elaboración del artículo.
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Recibido: 2 de mayo de 2020
Aprobado: 11 de noviembre de 2020
17
cc
BY
NC
ND
REE Volumen 15(1) Riobamba ene. - abr. 2021
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
ISSN-impreso 1390-7581
ISSN-digital 2661-6742
Evaluación de la susceptibilidad de Enterococcus faecalis ATCC-29212 frente a medica-
mentos combinados con hidróxido de calcio
Evaluation of the susceptibility of Enterococcus faecalis ATCC-29212 to drugs combined
with calcium hydroxide
https://doi.org/10.37135/ee.04.10.02
Autores:
Doménica Mishelly Rodríguez Robalino1 – https://orcid.org/00000002-0261-4909
Silvia Alexandra Reinoso Ortiz2 – https://orcid.org/00000002-8895-8947
Silvia Verónica Vallejo Lara2 – https://orcid.org/00000001-9857-4157
Paola Natali Paredes Chinizaca2– https://orcid.org/0000-0003-0453-7019
1Centro de Salud Tipo B Guano, Guano, Ecuador
2Universidad Nacional de Chimborazo, Riobamba, Ecuador
Autor de correspondencia: Silvia Alexandra Reinoso Ortiz. Universidad Nacional de Chimbo-
razo. Av. Antonio José de Sucre, Via a Guano. Riobamba, Chimborazo Ecuador. Teléfono:
0998285461. Email: sreinoso@unach.edu.ec
RESUMEN
La elevada incidencia del Enterococcus faecalis en procedimientos odontológicos es un tópico de
interés para el área de la salud, esta bacteria resiste a varios antimicrobianos y su proliferación
aumenta debido a su baja susceptibilidad a sustancias de uso convencional como el hidróxido de
calcio, convirtiéndose en una de las principales causas del fracaso de los tratamientos de conduc-
to. La presente investigación evaluó la susceptibilidad in vitro del Enterococcus faecalis cepa
ATCC-29212 frente a la combinación de sustancias y antibióticos con el hidróxido de calcio. Se
utilizó la técnica de difusión en agar, inoculando el microorganismo en cajas de Petri con agar
Cerebro Corazón (BHI), tratado con discos de papel filtro impregnados con 1µl de cada trata-
miento por triplicado; T1 (Hidróxido de Calcio + propilenglicol), T2 (Hidróxido de Calcio +
paramonoclorofenol), T3 (Hidróxido de Calcio + ampicilina gentamicina + propilenglicol), T4
(Hidróxido de Calcio + Solución Salina Fisiológica), Control positivo (medicamento comercial a
base de Hidróxido de Calcio), se incubó a 35°C durante 24h, los halos formados alrededor de
cada disco fueron medidos y comparados con la escala de Duraffourd y procesados mediante
ANOVA de un factor. Se obtuvo una medida del halo de inhibición de 22,50±3,3 mm, con el trata-
miento T3, siendo sumamente sensible. Concluyendo que este resultó el más efectivo en compa-
ración el resto de la pruebas in vitro en comparación con el resto de los fármaco investigados.
Palabras clave: Enterococcus faecalis, hidróxido de calcio, ampicilina, gentamicina.
ABSTRACT
The high incidence of Enterococcus faecalis in dental procedures is a topic of interest for the
health area. This bacterium resists various antimicrobials and its proliferation increases due to
its low susceptibility to substances of conventional use such as calcium hydroxide, becoming a
of the main causes of root canal failure. The present investigation evaluated the in vitro suscepti-
bility of Enterococcus faecalis strain ATCC-29212 to the combination of substances and antibio-
tics with calcium hydroxide. The agar diffusion technique was used, inoculating the microorga-
nism in Petri dishes with Brain Heart agar (BHI), treated with filter paper disks impregnated
with 1µl of each treatment in triplicate; T1 (Calcium Hydroxide + propylene glycol), T2 (Cal-
cium Hydroxide + paramonochlorophenol), T3 (Calcium Hydroxide + ampicillin gentamicin +
propylene glycol), T4 (Calcium Hydroxide + Physiological Saline Solution), Positive control
(Hydroxide-based commercial medicine Calcium), incubated at 35 ° C for 24h, the halos formed
around each disc were measured and compared with the Duraffourd scale and processed by
one-factor ANOVA. A measure of the inhibition halo of 22.50 ± 3.3 mm was obtained with the
T3 treatment, being extremely sensitive. It was concluded that this was the most effective in
comparison with the rest of the in vitro tests of the rest of the investigated drugs.
Keywords: Enterococcus Faecalis, Calcium Hydroxide, Ampicillin, Gentamicin.
INTRODUCCIÓN
Enterococcus faecalis es un microorganismo anaerobio facultativo, Gram positivo, inmóvil, no
esporulado que coloniza el tracto gastrointestinal y forma parte de la microbiota normal de la
saliva.
(1,2)
Sin embargo, con la aparición de la terapia antibiótica, se ha convertido en un patóge-
no oportunista resistente que puede permanecer dentro de los conductos radiculares incluso
después de la instrumentación endodóntica,
(3,4)
siendo una de las principales causas del fracaso
en el tratamiento de conducto, debido a que componentes estructurales como el colágeno y la
fibronectina ayudan a la adhesión de la bacteria en tejidos y dentina. También favorece la apari-
ción de enfermedades periapicales por su capacidad de apoptosis y piroptosis a las células.
(3,5-7)
Partiendo de que, la eliminación de los microorganismos y la prevención de la reinfección
dentro del conducto radicular es el principal objetivo del tratamiento endodóntico.
(8,9)
En enfer-
medades pulpares severas, la razón primordial del fracaso de un tratamiento de conducto está
dada por que los microrganismos no son erradicados totalmente; tal como ocurre en la necrosis
pulpar debido a un estado de putrefacción del nervio por la presencia de gran cantidad de microorga-
nismos, sin que exista antibacterianos de amplio potencial de eliminación o limpieza deficiente.
(10-12)
Los desechos producidos por Enterococcus faecalis constituyen un factor etiológico de las
enfermedades pulpares, especialmente de la necrosis pulpar. La principal causa de retratamiento
es la eliminación incompleta de ese tejido contenido en un complejo sistema de conductos,
quedando presentes microorganismos en la porción apical de la raíz fundamentalmente.
(1,13,14)
La
obturación inadecuada da la oportunidad a estos microorganismos para que colonicen estas
zonas y sobreviva a los materiales medicamentosos y obtenga alimento.
(9,13)
La presencia de este microorganismo no se manifiesta únicamente en los fallos de tratamientos
endodónticos, En algunos estudios, se ha encontrado en raíces del 70% de los casos de obtura-
ción por periodontitis apical.
(12)
Enterococcus faecalis estuvo presente en el 60% de tratamientos
endodónticos fallidos y en un 25% de piezas dentales sometidas al tratamiento. Se ha observado
que la bacteria tiene la capacidad degradativa similar a la esterasa, pudiendo afectar los compo-
nentes de la resina ocasionando la contaminación de la pieza dental.
(4,15,16)
El Hidróxido de Calcio constituye la sustancia antibacteriana más utilizada en el tratamiento
endodóntico,
(4,7)
debido a que su alto pH destruye la membrana celular bacteriana y las estructu-
ras de proteínas;
(17)
sin embargo, varios estudios demuestran que Enterococcus faecalis puede
ser resistente a varios antibacterianos incluyendo ese medicamento.
(1,4,18)
La eliminación de este
microrganismo por medios convencionales puede llegar a ser poco eficaz, haciéndose necesaria
la investigación de nuevos fármacos que potencien la acción de este o como alternativa terapéutica.
Así, el objetivo de la presente investigación fue evaluar la susceptibilidad in vitro del Enterococ-
cus faecalis ATCC- 29212 frente a la combinación de diferentes sustancias y medicamentos
antimicrobianos (propilenglicol, paramonoclorofenol, ampicilina + gentamicina + propilengli-
col) con Hidróxido de Calcio.
MATERIAL Y MÉTODOS
El presente estudio corresponde a una investigación aplicada, descriptiva transversal y experi-
mental que se desarrolló en el Laboratorio de Microbiología de la Universidad Nacional de
Chimborazo, durante los meses de junio y julio de 2019, cuyo procedimiento metodológico se
describe a continuación.
La actividad antibacteriana se realizó mediante el método de difusión en agar
Los estudios de la actividad antimicrobiana se llevaron a cabo utilizando la técnica de Kirby
Bauer
(19)
mediante el siguiente procedimiento:
1. Se preparó una combinación de diferentes sustancias y medicamentos antimicrobianos
(propilenglicol, paramonoclorofenol, ampicilina + gentamicina + propilenglicol) con
Hidróxido de Calcio a los que se les denominó Tratamientos (T) quedando conformados
de la manera siguiente: T1:Hidróxido de Calcio + propilenglicol, T2: Hidróxido de
Calcio + paramonoclorofenol, T3: Hidróxido de Calcio + ampicilina gentamicina +
propilenglicol, T4: Hidróxido de Calcio + suero fisiológico, el Control positivo fue una
pasta comercial a base de Hidróxido de Calcio.
2. Se utilizó una cepa bacteriana de Enterococcus faecalis ATCC- 29212 que provenía de
un cultivo fresco y puro, obtenido en agar.
3. Del cultivo fresco se preparó un inóculo bacteriano de 1,5 x 108 UFC/mL a partir de la
cepa bacteriana estudiada, el crecimiento bacteriano se ajustó a la turbidez del patrón 0.5
de McFarland.
(20)
4. La muestra bacteriana se obtuvo con un hisopo de algodón estéril introducido dentro del
tubo que contenía el inóculo estandarizado en el paso anterior. El exceso de líquido se
eliminó haciendo rotar suavemente el hisopo contra las paredes del tubo.
5. Con el hisopo debidamente humedecido, se inoculó en tres o cuatro direcciones toda la
superficie de una placa con agar Cerebro Corazón (BHI) girando sucesivamente dicha
placa en ángulos de 90º. Se dejó secar el inóculo a temperatura ambiente durante unos
minutos.
6. La evaluación de la actividad antibacteriana se realizó por triplicado, por lo tanto, en
series de 3 cajas de Petri se colocó con una pinza estéril en forma equidistante sobre la
superficie del agar en cada placa dos discos de papel filtro con 1µl de cada uno de los
tratamientos: T1, T2, T3, T4 y control positivo.
7. Se incubaron las placas en una estufa de cultivo a una temperatura de 35 ºC, en atmósfera
aeróbica.
8. La lectura de las placas se realizó después de 24 horas de incubación, la aparición de
halos de inhibición del crecimiento bacteriano alrededor de los discos permitió determi-
nar la actividad antimicrobiana, se midió el diámetro de los halos de inhibición y se reali-
zó la comparación de los mismos con la escala de Duraffourd,(21) siendo nula (menor o
igual a 8 mm), sensible (de 9 a 14 mm), muy sensible (de 15 a 19 mm) y sumamente
sensible (igual o superior a 20 mm).
Los datos obtenidos fueron procesados empleando el programa en SPSS Statistics 21.0, se reali-
zó un análisis de varianza para comparar múltiples medias ANOVA y método de Tukey para
crear intervalos de confianza en subconjuntos homogéneos, lo que permitió ejecutar compara-
ciones de medias entre los tratamientos (medicamentos combinados con Hidróxido de Calcio) y
elegir al tratamiento con mayor susceptibilidad frente a Enterococcus faecalis cepa
ATCC-29212.
Los investigadores utilizaron las instalaciones de laboratorio certificadas de la Universidad
Nacional de Chimborazo, siguiendo el protocolo establecido de bioseguridad para este tipo de
trabajo. El estudio contó con la aprobación de las comisiones a nivel de las respectivas carrera y
facultad.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Los resultados del estudio in vitro de la actividad antibacteriana de los cuatro tratamientos
propuestos (T1, T2, T3 y T4) y del control positivo (Hidróxido de Calcio pasta) sobre la especie
bacteriana: Enterococcus faecalis ATCC- 29212, permitió establecer la sensibilidad de esa
bacteria ante estos.
Aunque se observó sensibilidad ante cada sustancia utilizada, el tratamiento 3 (T3), empleando
Hidróxido de Calcio + ampicilina gentamicina + propilenglicol, arrojó los resultados más favo-
rables en la terapéutica antibacteriana dirigida al Enterococcus faecalis ATCC- 29212, microor-
ganismo que resultó sumamente sensible (X =22.5 mm) ante ese fármaco según la escala de
Duraffourd
(21)
(tabla 1).
Tabla 1. Sensibilidad de las combinaciones de medicamentos
El análisis de varianza de los valores medios de los halos de inhibición obtenidos al tratar in
vitro a la bacteria estudiada mediante diferentes combinaciones de tratamientos, obteniéndose
un valor de probabilidad significativo (0,002), lo que permite inferir que al menos uno de los
tratamientos comparados fue diferente (tabla 2).
Tabla 2. Análisis de varianza de las medias de los tratamientos
La prueba de Tukey de igualdad de medias de los grupos en subgrupos homogéneos permitió
identificar que el tratamiento 3 (T3) consigue que el diámetro medio de los halos de inhibición
se maximice (tabla 3).
Tabla 3. Igualdad de medias de Tukey
Los resultados de esta investigación concuerdan con los obtenidos en otros estudios,
(22,23,24,25)
en
los que se refiere la existencia de variaciones relativas a la resistencias, intrínsecas o adquiridas
por la bacteria Enterococcus faecalis. La terapia estándar está dada por el uso de ampicilina más
un aminoglucósido, de conjunto esas sustancias permiten un efecto sinérgico que incrementa la
actividad bactericida de los antibióticos.
Gavaldá et al.
(26)
reportan que el tratamiento experimental de la endocarditis resultó ser efectivo
mediante la combinación de ampicilina y gentamicina, con el objetivo de reforzar la acción de
la primera utilizándola de conjunto con otra que inhiba la síntesis de la pared celular del
microorganismo patógeno. Al respecto, también se sugiere el uso de una cefalosporina como la
ceftriaxona cuando existe resistencia adquirida de alto nivel a la gentamicina, anulando la siner-
gia de la unión antibiótica. Esos autores recomiendan la utilización de la combinación de ampi-
cilina más ceftriaxona por ser esta menos nefrotóxica en pacientes con problemas renales.
De acuerdo con el estudio realizado por Causse et al.,
(27)
El Enterococcus faecalis resulta más
sensible ante los betalactámicos como la ampicilina y la amoxicilina más ácido clavulánico, con
un 98% y 99% respectivamente; seguido de los aminoglucósidos como la gentamicina(76%), la
que causó mayor efecto en comparación con la estreptomicina (56%), lo que permite suponer la
existencia de un efecto sinérgico realizar terapia combinada mediante ampicilina y gentamicina,
coincidiendo con los resultados de la presente investigación. El tiempo estimado para que un
medicamento intraconducto cumpla su función oscila entre el tercer día y el séptimo día en
dependencia de la magnitud de la infección, la resistencia bacteriana y la respuesta del organis-
mo del paciente.
CONCLUSIONES
La evaluación in vitro permitió establecer que el tratamiento T3(Hidróxido de calcio + ampicili-
na, gentamicina y propilenglicol) resultó el más efectivo para inhibir al Enterococcus faecalis
cepa ATCC-29212, pudiendo potenciarse su acción a mayor tiempo de exposición. Lo que indica
que constituye una excelente alternativa farmacológica viable en intervenciones intraconducto,
ante una posible resistencia microbiana para evitar fracasos terapéuticos endodónticos.
Conflicto de intereses: los autores declaran no tener
Declaración de contribuciones:
Doménica Mishelly Rodríguez Robalino, Silvia Alexandra Reinoso Ortiz, Silvia Verónica Valle-
jo Lara, Paola Natalí Paredes Chinizaca, trabajaron en el desarrollo del proyecto, análisis micro-
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Recibido: 2 de mayo de 2020
Aprobado: 11 de noviembre de 2020
18
cc
BY
NC
ND
REE Volumen 15(1) Riobamba ene. - abr. 2021
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
ISSN-impreso 1390-7581
ISSN-digital 2661-6742
Evaluación de la susceptibilidad de Enterococcus faecalis ATCC-29212 frente a medica-
mentos combinados con hidróxido de calcio
Evaluation of the susceptibility of Enterococcus faecalis ATCC-29212 to drugs combined
with calcium hydroxide
https://doi.org/10.37135/ee.04.10.02
Autores:
Doménica Mishelly Rodríguez Robalino1 – https://orcid.org/00000002-0261-4909
Silvia Alexandra Reinoso Ortiz2 – https://orcid.org/00000002-8895-8947
Silvia Verónica Vallejo Lara2 – https://orcid.org/00000001-9857-4157
Paola Natali Paredes Chinizaca2– https://orcid.org/0000-0003-0453-7019
1Centro de Salud Tipo B Guano, Guano, Ecuador
2Universidad Nacional de Chimborazo, Riobamba, Ecuador
Autor de correspondencia: Silvia Alexandra Reinoso Ortiz. Universidad Nacional de Chimbo-
razo. Av. Antonio José de Sucre, Via a Guano. Riobamba, Chimborazo Ecuador. Teléfono:
0998285461. Email: sreinoso@unach.edu.ec
RESUMEN
La elevada incidencia del Enterococcus faecalis en procedimientos odontológicos es un tópico de
interés para el área de la salud, esta bacteria resiste a varios antimicrobianos y su proliferación
aumenta debido a su baja susceptibilidad a sustancias de uso convencional como el hidróxido de
calcio, convirtiéndose en una de las principales causas del fracaso de los tratamientos de conduc-
to. La presente investigación evaluó la susceptibilidad in vitro del Enterococcus faecalis cepa
ATCC-29212 frente a la combinación de sustancias y antibióticos con el hidróxido de calcio. Se
utilizó la técnica de difusión en agar, inoculando el microorganismo en cajas de Petri con agar
Cerebro Corazón (BHI), tratado con discos de papel filtro impregnados con 1µl de cada trata-
miento por triplicado; T1 (Hidróxido de Calcio + propilenglicol), T2 (Hidróxido de Calcio +
paramonoclorofenol), T3 (Hidróxido de Calcio + ampicilina gentamicina + propilenglicol), T4
(Hidróxido de Calcio + Solución Salina Fisiológica), Control positivo (medicamento comercial a
base de Hidróxido de Calcio), se incubó a 35°C durante 24h, los halos formados alrededor de
cada disco fueron medidos y comparados con la escala de Duraffourd y procesados mediante
ANOVA de un factor. Se obtuvo una medida del halo de inhibición de 22,50±3,3 mm, con el trata-
miento T3, siendo sumamente sensible. Concluyendo que este resultó el más efectivo en compa-
ración el resto de la pruebas in vitro en comparación con el resto de los fármaco investigados.
Palabras clave: Enterococcus faecalis, hidróxido de calcio, ampicilina, gentamicina.
ABSTRACT
The high incidence of Enterococcus faecalis in dental procedures is a topic of interest for the
health area. This bacterium resists various antimicrobials and its proliferation increases due to
its low susceptibility to substances of conventional use such as calcium hydroxide, becoming a
of the main causes of root canal failure. The present investigation evaluated the in vitro suscepti-
bility of Enterococcus faecalis strain ATCC-29212 to the combination of substances and antibio-
tics with calcium hydroxide. The agar diffusion technique was used, inoculating the microorga-
nism in Petri dishes with Brain Heart agar (BHI), treated with filter paper disks impregnated
with 1µl of each treatment in triplicate; T1 (Calcium Hydroxide + propylene glycol), T2 (Cal-
cium Hydroxide + paramonochlorophenol), T3 (Calcium Hydroxide + ampicillin gentamicin +
propylene glycol), T4 (Calcium Hydroxide + Physiological Saline Solution), Positive control
(Hydroxide-based commercial medicine Calcium), incubated at 35 ° C for 24h, the halos formed
around each disc were measured and compared with the Duraffourd scale and processed by
one-factor ANOVA. A measure of the inhibition halo of 22.50 ± 3.3 mm was obtained with the
T3 treatment, being extremely sensitive. It was concluded that this was the most effective in
comparison with the rest of the in vitro tests of the rest of the investigated drugs.
Keywords: Enterococcus Faecalis, Calcium Hydroxide, Ampicillin, Gentamicin.
INTRODUCCIÓN
Enterococcus faecalis es un microorganismo anaerobio facultativo, Gram positivo, inmóvil, no
esporulado que coloniza el tracto gastrointestinal y forma parte de la microbiota normal de la
saliva.
(1,2)
Sin embargo, con la aparición de la terapia antibiótica, se ha convertido en un patóge-
no oportunista resistente que puede permanecer dentro de los conductos radiculares incluso
después de la instrumentación endodóntica,
(3,4)
siendo una de las principales causas del fracaso
en el tratamiento de conducto, debido a que componentes estructurales como el colágeno y la
fibronectina ayudan a la adhesión de la bacteria en tejidos y dentina. También favorece la apari-
ción de enfermedades periapicales por su capacidad de apoptosis y piroptosis a las células.
(3,5-7)
Partiendo de que, la eliminación de los microorganismos y la prevención de la reinfección
dentro del conducto radicular es el principal objetivo del tratamiento endodóntico.
(8,9)
En enfer-
medades pulpares severas, la razón primordial del fracaso de un tratamiento de conducto está
dada por que los microrganismos no son erradicados totalmente; tal como ocurre en la necrosis
pulpar debido a un estado de putrefacción del nervio por la presencia de gran cantidad de microorga-
nismos, sin que exista antibacterianos de amplio potencial de eliminación o limpieza deficiente.
(10-12)
Los desechos producidos por Enterococcus faecalis constituyen un factor etiológico de las
enfermedades pulpares, especialmente de la necrosis pulpar. La principal causa de retratamiento
es la eliminación incompleta de ese tejido contenido en un complejo sistema de conductos,
quedando presentes microorganismos en la porción apical de la raíz fundamentalmente.
(1,13,14)
La
obturación inadecuada da la oportunidad a estos microorganismos para que colonicen estas
zonas y sobreviva a los materiales medicamentosos y obtenga alimento.
(9,13)
La presencia de este microorganismo no se manifiesta únicamente en los fallos de tratamientos
endodónticos, En algunos estudios, se ha encontrado en raíces del 70% de los casos de obtura-
ción por periodontitis apical.
(12)
Enterococcus faecalis estuvo presente en el 60% de tratamientos
endodónticos fallidos y en un 25% de piezas dentales sometidas al tratamiento. Se ha observado
que la bacteria tiene la capacidad degradativa similar a la esterasa, pudiendo afectar los compo-
nentes de la resina ocasionando la contaminación de la pieza dental.
(4,15,16)
El Hidróxido de Calcio constituye la sustancia antibacteriana más utilizada en el tratamiento
endodóntico,
(4,7)
debido a que su alto pH destruye la membrana celular bacteriana y las estructu-
ras de proteínas;
(17)
sin embargo, varios estudios demuestran que Enterococcus faecalis puede
ser resistente a varios antibacterianos incluyendo ese medicamento.
(1,4,18)
La eliminación de este
microrganismo por medios convencionales puede llegar a ser poco eficaz, haciéndose necesaria
la investigación de nuevos fármacos que potencien la acción de este o como alternativa terapéutica.
Así, el objetivo de la presente investigación fue evaluar la susceptibilidad in vitro del Enterococ-
cus faecalis ATCC- 29212 frente a la combinación de diferentes sustancias y medicamentos
antimicrobianos (propilenglicol, paramonoclorofenol, ampicilina + gentamicina + propilengli-
col) con Hidróxido de Calcio.
MATERIAL Y MÉTODOS
El presente estudio corresponde a una investigación aplicada, descriptiva transversal y experi-
mental que se desarrolló en el Laboratorio de Microbiología de la Universidad Nacional de
Chimborazo, durante los meses de junio y julio de 2019, cuyo procedimiento metodológico se
describe a continuación.
La actividad antibacteriana se realizó mediante el método de difusión en agar
Los estudios de la actividad antimicrobiana se llevaron a cabo utilizando la técnica de Kirby
Bauer
(19)
mediante el siguiente procedimiento:
1. Se preparó una combinación de diferentes sustancias y medicamentos antimicrobianos
(propilenglicol, paramonoclorofenol, ampicilina + gentamicina + propilenglicol) con
Hidróxido de Calcio a los que se les denominó Tratamientos (T) quedando conformados
de la manera siguiente: T1:Hidróxido de Calcio + propilenglicol, T2: Hidróxido de
Calcio + paramonoclorofenol, T3: Hidróxido de Calcio + ampicilina gentamicina +
propilenglicol, T4: Hidróxido de Calcio + suero fisiológico, el Control positivo fue una
pasta comercial a base de Hidróxido de Calcio.
2. Se utilizó una cepa bacteriana de Enterococcus faecalis ATCC- 29212 que provenía de
un cultivo fresco y puro, obtenido en agar.
3. Del cultivo fresco se preparó un inóculo bacteriano de 1,5 x 108 UFC/mL a partir de la
cepa bacteriana estudiada, el crecimiento bacteriano se ajustó a la turbidez del patrón 0.5
de McFarland.
(20)
4. La muestra bacteriana se obtuvo con un hisopo de algodón estéril introducido dentro del
tubo que contenía el inóculo estandarizado en el paso anterior. El exceso de líquido se
eliminó haciendo rotar suavemente el hisopo contra las paredes del tubo.
5. Con el hisopo debidamente humedecido, se inoculó en tres o cuatro direcciones toda la
superficie de una placa con agar Cerebro Corazón (BHI) girando sucesivamente dicha
placa en ángulos de 90º. Se dejó secar el inóculo a temperatura ambiente durante unos
minutos.
6. La evaluación de la actividad antibacteriana se realizó por triplicado, por lo tanto, en
series de 3 cajas de Petri se colocó con una pinza estéril en forma equidistante sobre la
superficie del agar en cada placa dos discos de papel filtro con 1µl de cada uno de los
tratamientos: T1, T2, T3, T4 y control positivo.
7. Se incubaron las placas en una estufa de cultivo a una temperatura de 35 ºC, en atmósfera
aeróbica.
8. La lectura de las placas se realizó después de 24 horas de incubación, la aparición de
halos de inhibición del crecimiento bacteriano alrededor de los discos permitió determi-
nar la actividad antimicrobiana, se midió el diámetro de los halos de inhibición y se reali-
zó la comparación de los mismos con la escala de Duraffourd,(21) siendo nula (menor o
igual a 8 mm), sensible (de 9 a 14 mm), muy sensible (de 15 a 19 mm) y sumamente
sensible (igual o superior a 20 mm).
Los datos obtenidos fueron procesados empleando el programa en SPSS Statistics 21.0, se reali-
zó un análisis de varianza para comparar múltiples medias ANOVA y método de Tukey para
crear intervalos de confianza en subconjuntos homogéneos, lo que permitió ejecutar compara-
ciones de medias entre los tratamientos (medicamentos combinados con Hidróxido de Calcio) y
elegir al tratamiento con mayor susceptibilidad frente a Enterococcus faecalis cepa
ATCC-29212.
Los investigadores utilizaron las instalaciones de laboratorio certificadas de la Universidad
Nacional de Chimborazo, siguiendo el protocolo establecido de bioseguridad para este tipo de
trabajo. El estudio contó con la aprobación de las comisiones a nivel de las respectivas carrera y
facultad.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Los resultados del estudio in vitro de la actividad antibacteriana de los cuatro tratamientos
propuestos (T1, T2, T3 y T4) y del control positivo (Hidróxido de Calcio pasta) sobre la especie
bacteriana: Enterococcus faecalis ATCC- 29212, permitió establecer la sensibilidad de esa
bacteria ante estos.
Aunque se observó sensibilidad ante cada sustancia utilizada, el tratamiento 3 (T3), empleando
Hidróxido de Calcio + ampicilina gentamicina + propilenglicol, arrojó los resultados más favo-
rables en la terapéutica antibacteriana dirigida al Enterococcus faecalis ATCC- 29212, microor-
ganismo que resultó sumamente sensible (X =22.5 mm) ante ese fármaco según la escala de
Duraffourd
(21)
(tabla 1).
Tabla 1. Sensibilidad de las combinaciones de medicamentos
El análisis de varianza de los valores medios de los halos de inhibición obtenidos al tratar in
vitro a la bacteria estudiada mediante diferentes combinaciones de tratamientos, obteniéndose
un valor de probabilidad significativo (0,002), lo que permite inferir que al menos uno de los
tratamientos comparados fue diferente (tabla 2).
Tabla 2. Análisis de varianza de las medias de los tratamientos
La prueba de Tukey de igualdad de medias de los grupos en subgrupos homogéneos permitió
identificar que el tratamiento 3 (T3) consigue que el diámetro medio de los halos de inhibición
se maximice (tabla 3).
Tabla 3. Igualdad de medias de Tukey
Los resultados de esta investigación concuerdan con los obtenidos en otros estudios,
(22,23,24,25)
en
los que se refiere la existencia de variaciones relativas a la resistencias, intrínsecas o adquiridas
por la bacteria Enterococcus faecalis. La terapia estándar está dada por el uso de ampicilina más
un aminoglucósido, de conjunto esas sustancias permiten un efecto sinérgico que incrementa la
actividad bactericida de los antibióticos.
Gavaldá et al.
(26)
reportan que el tratamiento experimental de la endocarditis resultó ser efectivo
mediante la combinación de ampicilina y gentamicina, con el objetivo de reforzar la acción de
la primera utilizándola de conjunto con otra que inhiba la síntesis de la pared celular del
microorganismo patógeno. Al respecto, también se sugiere el uso de una cefalosporina como la
ceftriaxona cuando existe resistencia adquirida de alto nivel a la gentamicina, anulando la siner-
gia de la unión antibiótica. Esos autores recomiendan la utilización de la combinación de ampi-
cilina más ceftriaxona por ser esta menos nefrotóxica en pacientes con problemas renales.
De acuerdo con el estudio realizado por Causse et al.,
(27)
El Enterococcus faecalis resulta más
sensible ante los betalactámicos como la ampicilina y la amoxicilina más ácido clavulánico, con
un 98% y 99% respectivamente; seguido de los aminoglucósidos como la gentamicina(76%), la
que causó mayor efecto en comparación con la estreptomicina (56%), lo que permite suponer la
existencia de un efecto sinérgico realizar terapia combinada mediante ampicilina y gentamicina,
coincidiendo con los resultados de la presente investigación. El tiempo estimado para que un
medicamento intraconducto cumpla su función oscila entre el tercer día y el séptimo día en
dependencia de la magnitud de la infección, la resistencia bacteriana y la respuesta del organis-
mo del paciente.
CONCLUSIONES
La evaluación in vitro permitió establecer que el tratamiento T3(Hidróxido de calcio + ampicili-
na, gentamicina y propilenglicol) resultó el más efectivo para inhibir al Enterococcus faecalis
cepa ATCC-29212, pudiendo potenciarse su acción a mayor tiempo de exposición. Lo que indica
que constituye una excelente alternativa farmacológica viable en intervenciones intraconducto,
ante una posible resistencia microbiana para evitar fracasos terapéuticos endodónticos.
Conflicto de intereses: los autores declaran no tener
Declaración de contribuciones:
Doménica Mishelly Rodríguez Robalino, Silvia Alexandra Reinoso Ortiz, Silvia Verónica Valle-
jo Lara, Paola Natalí Paredes Chinizaca, trabajaron en el desarrollo del proyecto, análisis micro-
biológico, recogida e interpretación de datos y la elaboración del artículo.
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Aprobado: 11 de noviembre de 2020
19
cc
BY
NC
ND
REE Volumen 15(1) Riobamba ene. - abr. 2021
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
ISSN-impreso 1390-7581
ISSN-digital 2661-6742
Evaluación de la susceptibilidad de Enterococcus faecalis ATCC-29212 frente a medica-
mentos combinados con hidróxido de calcio
Evaluation of the susceptibility of Enterococcus faecalis ATCC-29212 to drugs combined
with calcium hydroxide
https://doi.org/10.37135/ee.04.10.02
Autores:
Doménica Mishelly Rodríguez Robalino1 – https://orcid.org/00000002-0261-4909
Silvia Alexandra Reinoso Ortiz2 – https://orcid.org/00000002-8895-8947
Silvia Verónica Vallejo Lara2 – https://orcid.org/00000001-9857-4157
Paola Natali Paredes Chinizaca2– https://orcid.org/0000-0003-0453-7019
1Centro de Salud Tipo B Guano, Guano, Ecuador
2Universidad Nacional de Chimborazo, Riobamba, Ecuador
Autor de correspondencia: Silvia Alexandra Reinoso Ortiz. Universidad Nacional de Chimbo-
razo. Av. Antonio José de Sucre, Via a Guano. Riobamba, Chimborazo Ecuador. Teléfono:
0998285461. Email: sreinoso@unach.edu.ec
RESUMEN
La elevada incidencia del Enterococcus faecalis en procedimientos odontológicos es un tópico de
interés para el área de la salud, esta bacteria resiste a varios antimicrobianos y su proliferación
aumenta debido a su baja susceptibilidad a sustancias de uso convencional como el hidróxido de
calcio, convirtiéndose en una de las principales causas del fracaso de los tratamientos de conduc-
to. La presente investigación evaluó la susceptibilidad in vitro del Enterococcus faecalis cepa
ATCC-29212 frente a la combinación de sustancias y antibióticos con el hidróxido de calcio. Se
utilizó la técnica de difusión en agar, inoculando el microorganismo en cajas de Petri con agar
Cerebro Corazón (BHI), tratado con discos de papel filtro impregnados con 1µl de cada trata-
miento por triplicado; T1 (Hidróxido de Calcio + propilenglicol), T2 (Hidróxido de Calcio +
paramonoclorofenol), T3 (Hidróxido de Calcio + ampicilina gentamicina + propilenglicol), T4
(Hidróxido de Calcio + Solución Salina Fisiológica), Control positivo (medicamento comercial a
base de Hidróxido de Calcio), se incubó a 35°C durante 24h, los halos formados alrededor de
cada disco fueron medidos y comparados con la escala de Duraffourd y procesados mediante
ANOVA de un factor. Se obtuvo una medida del halo de inhibición de 22,50±3,3 mm, con el trata-
miento T3, siendo sumamente sensible. Concluyendo que este resultó el más efectivo en compa-
ración el resto de la pruebas in vitro en comparación con el resto de los fármaco investigados.
Palabras clave: Enterococcus faecalis, hidróxido de calcio, ampicilina, gentamicina.
ABSTRACT
The high incidence of Enterococcus faecalis in dental procedures is a topic of interest for the
health area. This bacterium resists various antimicrobials and its proliferation increases due to
its low susceptibility to substances of conventional use such as calcium hydroxide, becoming a
of the main causes of root canal failure. The present investigation evaluated the in vitro suscepti-
bility of Enterococcus faecalis strain ATCC-29212 to the combination of substances and antibio-
tics with calcium hydroxide. The agar diffusion technique was used, inoculating the microorga-
nism in Petri dishes with Brain Heart agar (BHI), treated with filter paper disks impregnated
with 1µl of each treatment in triplicate; T1 (Calcium Hydroxide + propylene glycol), T2 (Cal-
cium Hydroxide + paramonochlorophenol), T3 (Calcium Hydroxide + ampicillin gentamicin +
propylene glycol), T4 (Calcium Hydroxide + Physiological Saline Solution), Positive control
(Hydroxide-based commercial medicine Calcium), incubated at 35 ° C for 24h, the halos formed
around each disc were measured and compared with the Duraffourd scale and processed by
one-factor ANOVA. A measure of the inhibition halo of 22.50 ± 3.3 mm was obtained with the
T3 treatment, being extremely sensitive. It was concluded that this was the most effective in
comparison with the rest of the in vitro tests of the rest of the investigated drugs.
Keywords: Enterococcus Faecalis, Calcium Hydroxide, Ampicillin, Gentamicin.
INTRODUCCIÓN
Enterococcus faecalis es un microorganismo anaerobio facultativo, Gram positivo, inmóvil, no
esporulado que coloniza el tracto gastrointestinal y forma parte de la microbiota normal de la
saliva.
(1,2)
Sin embargo, con la aparición de la terapia antibiótica, se ha convertido en un patóge-
no oportunista resistente que puede permanecer dentro de los conductos radiculares incluso
después de la instrumentación endodóntica,
(3,4)
siendo una de las principales causas del fracaso
en el tratamiento de conducto, debido a que componentes estructurales como el colágeno y la
fibronectina ayudan a la adhesión de la bacteria en tejidos y dentina. También favorece la apari-
ción de enfermedades periapicales por su capacidad de apoptosis y piroptosis a las células.
(3,5-7)
Partiendo de que, la eliminación de los microorganismos y la prevención de la reinfección
dentro del conducto radicular es el principal objetivo del tratamiento endodóntico.
(8,9)
En enfer-
medades pulpares severas, la razón primordial del fracaso de un tratamiento de conducto está
dada por que los microrganismos no son erradicados totalmente; tal como ocurre en la necrosis
pulpar debido a un estado de putrefacción del nervio por la presencia de gran cantidad de microorga-
nismos, sin que exista antibacterianos de amplio potencial de eliminación o limpieza deficiente.
(10-12)
Los desechos producidos por Enterococcus faecalis constituyen un factor etiológico de las
enfermedades pulpares, especialmente de la necrosis pulpar. La principal causa de retratamiento
es la eliminación incompleta de ese tejido contenido en un complejo sistema de conductos,
quedando presentes microorganismos en la porción apical de la raíz fundamentalmente.
(1,13,14)
La
obturación inadecuada da la oportunidad a estos microorganismos para que colonicen estas
zonas y sobreviva a los materiales medicamentosos y obtenga alimento.
(9,13)
La presencia de este microorganismo no se manifiesta únicamente en los fallos de tratamientos
endodónticos, En algunos estudios, se ha encontrado en raíces del 70% de los casos de obtura-
ción por periodontitis apical.
(12)
Enterococcus faecalis estuvo presente en el 60% de tratamientos
endodónticos fallidos y en un 25% de piezas dentales sometidas al tratamiento. Se ha observado
que la bacteria tiene la capacidad degradativa similar a la esterasa, pudiendo afectar los compo-
nentes de la resina ocasionando la contaminación de la pieza dental.
(4,15,16)
El Hidróxido de Calcio constituye la sustancia antibacteriana más utilizada en el tratamiento
endodóntico,
(4,7)
debido a que su alto pH destruye la membrana celular bacteriana y las estructu-
ras de proteínas;
(17)
sin embargo, varios estudios demuestran que Enterococcus faecalis puede
ser resistente a varios antibacterianos incluyendo ese medicamento.
(1,4,18)
La eliminación de este
microrganismo por medios convencionales puede llegar a ser poco eficaz, haciéndose necesaria
la investigación de nuevos fármacos que potencien la acción de este o como alternativa terapéutica.
Así, el objetivo de la presente investigación fue evaluar la susceptibilidad in vitro del Enterococ-
cus faecalis ATCC- 29212 frente a la combinación de diferentes sustancias y medicamentos
antimicrobianos (propilenglicol, paramonoclorofenol, ampicilina + gentamicina + propilengli-
col) con Hidróxido de Calcio.
MATERIAL Y MÉTODOS
El presente estudio corresponde a una investigación aplicada, descriptiva transversal y experi-
mental que se desarrolló en el Laboratorio de Microbiología de la Universidad Nacional de
Chimborazo, durante los meses de junio y julio de 2019, cuyo procedimiento metodológico se
describe a continuación.
La actividad antibacteriana se realizó mediante el método de difusión en agar
Los estudios de la actividad antimicrobiana se llevaron a cabo utilizando la técnica de Kirby
Bauer
(19)
mediante el siguiente procedimiento:
1. Se preparó una combinación de diferentes sustancias y medicamentos antimicrobianos
(propilenglicol, paramonoclorofenol, ampicilina + gentamicina + propilenglicol) con
Hidróxido de Calcio a los que se les denominó Tratamientos (T) quedando conformados
de la manera siguiente: T1:Hidróxido de Calcio + propilenglicol, T2: Hidróxido de
Calcio + paramonoclorofenol, T3: Hidróxido de Calcio + ampicilina gentamicina +
propilenglicol, T4: Hidróxido de Calcio + suero fisiológico, el Control positivo fue una
pasta comercial a base de Hidróxido de Calcio.
2. Se utilizó una cepa bacteriana de Enterococcus faecalis ATCC- 29212 que provenía de
un cultivo fresco y puro, obtenido en agar.
3. Del cultivo fresco se preparó un inóculo bacteriano de 1,5 x 108 UFC/mL a partir de la
cepa bacteriana estudiada, el crecimiento bacteriano se ajustó a la turbidez del patrón 0.5
de McFarland.
(20)
4. La muestra bacteriana se obtuvo con un hisopo de algodón estéril introducido dentro del
tubo que contenía el inóculo estandarizado en el paso anterior. El exceso de líquido se
eliminó haciendo rotar suavemente el hisopo contra las paredes del tubo.
5. Con el hisopo debidamente humedecido, se inoculó en tres o cuatro direcciones toda la
superficie de una placa con agar Cerebro Corazón (BHI) girando sucesivamente dicha
placa en ángulos de 90º. Se dejó secar el inóculo a temperatura ambiente durante unos
minutos.
6. La evaluación de la actividad antibacteriana se realizó por triplicado, por lo tanto, en
series de 3 cajas de Petri se colocó con una pinza estéril en forma equidistante sobre la
superficie del agar en cada placa dos discos de papel filtro con 1µl de cada uno de los
tratamientos: T1, T2, T3, T4 y control positivo.
7. Se incubaron las placas en una estufa de cultivo a una temperatura de 35 ºC, en atmósfera
aeróbica.
8. La lectura de las placas se realizó después de 24 horas de incubación, la aparición de
halos de inhibición del crecimiento bacteriano alrededor de los discos permitió determi-
nar la actividad antimicrobiana, se midió el diámetro de los halos de inhibición y se reali-
zó la comparación de los mismos con la escala de Duraffourd,(21) siendo nula (menor o
igual a 8 mm), sensible (de 9 a 14 mm), muy sensible (de 15 a 19 mm) y sumamente
sensible (igual o superior a 20 mm).
Los datos obtenidos fueron procesados empleando el programa en SPSS Statistics 21.0, se reali-
zó un análisis de varianza para comparar múltiples medias ANOVA y método de Tukey para
crear intervalos de confianza en subconjuntos homogéneos, lo que permitió ejecutar compara-
ciones de medias entre los tratamientos (medicamentos combinados con Hidróxido de Calcio) y
elegir al tratamiento con mayor susceptibilidad frente a Enterococcus faecalis cepa
ATCC-29212.
Los investigadores utilizaron las instalaciones de laboratorio certificadas de la Universidad
Nacional de Chimborazo, siguiendo el protocolo establecido de bioseguridad para este tipo de
trabajo. El estudio contó con la aprobación de las comisiones a nivel de las respectivas carrera y
facultad.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Los resultados del estudio in vitro de la actividad antibacteriana de los cuatro tratamientos
propuestos (T1, T2, T3 y T4) y del control positivo (Hidróxido de Calcio pasta) sobre la especie
bacteriana: Enterococcus faecalis ATCC- 29212, permitió establecer la sensibilidad de esa
bacteria ante estos.
Aunque se observó sensibilidad ante cada sustancia utilizada, el tratamiento 3 (T3), empleando
Hidróxido de Calcio + ampicilina gentamicina + propilenglicol, arrojó los resultados más favo-
rables en la terapéutica antibacteriana dirigida al Enterococcus faecalis ATCC- 29212, microor-
ganismo que resultó sumamente sensible (X =22.5 mm) ante ese fármaco según la escala de
Duraffourd
(21)
(tabla 1).
Tabla 1. Sensibilidad de las combinaciones de medicamentos
El análisis de varianza de los valores medios de los halos de inhibición obtenidos al tratar in
vitro a la bacteria estudiada mediante diferentes combinaciones de tratamientos, obteniéndose
un valor de probabilidad significativo (0,002), lo que permite inferir que al menos uno de los
tratamientos comparados fue diferente (tabla 2).
Tabla 2. Análisis de varianza de las medias de los tratamientos
La prueba de Tukey de igualdad de medias de los grupos en subgrupos homogéneos permitió
identificar que el tratamiento 3 (T3) consigue que el diámetro medio de los halos de inhibición
se maximice (tabla 3).
Tabla 3. Igualdad de medias de Tukey
Los resultados de esta investigación concuerdan con los obtenidos en otros estudios,
(22,23,24,25)
en
los que se refiere la existencia de variaciones relativas a la resistencias, intrínsecas o adquiridas
por la bacteria Enterococcus faecalis. La terapia estándar está dada por el uso de ampicilina más
un aminoglucósido, de conjunto esas sustancias permiten un efecto sinérgico que incrementa la
actividad bactericida de los antibióticos.
Gavaldá et al.
(26)
reportan que el tratamiento experimental de la endocarditis resultó ser efectivo
mediante la combinación de ampicilina y gentamicina, con el objetivo de reforzar la acción de
la primera utilizándola de conjunto con otra que inhiba la síntesis de la pared celular del
microorganismo patógeno. Al respecto, también se sugiere el uso de una cefalosporina como la
ceftriaxona cuando existe resistencia adquirida de alto nivel a la gentamicina, anulando la siner-
gia de la unión antibiótica. Esos autores recomiendan la utilización de la combinación de ampi-
cilina más ceftriaxona por ser esta menos nefrotóxica en pacientes con problemas renales.
De acuerdo con el estudio realizado por Causse et al.,
(27)
El Enterococcus faecalis resulta más
sensible ante los betalactámicos como la ampicilina y la amoxicilina más ácido clavulánico, con
un 98% y 99% respectivamente; seguido de los aminoglucósidos como la gentamicina(76%), la
que causó mayor efecto en comparación con la estreptomicina (56%), lo que permite suponer la
existencia de un efecto sinérgico realizar terapia combinada mediante ampicilina y gentamicina,
coincidiendo con los resultados de la presente investigación. El tiempo estimado para que un
medicamento intraconducto cumpla su función oscila entre el tercer día y el séptimo día en
dependencia de la magnitud de la infección, la resistencia bacteriana y la respuesta del organis-
mo del paciente.
CONCLUSIONES
La evaluación in vitro permitió establecer que el tratamiento T3(Hidróxido de calcio + ampicili-
na, gentamicina y propilenglicol) resultó el más efectivo para inhibir al Enterococcus faecalis
cepa ATCC-29212, pudiendo potenciarse su acción a mayor tiempo de exposición. Lo que indica
que constituye una excelente alternativa farmacológica viable en intervenciones intraconducto,
ante una posible resistencia microbiana para evitar fracasos terapéuticos endodónticos.
Conflicto de intereses: los autores declaran no tener
Declaración de contribuciones:
Doménica Mishelly Rodríguez Robalino, Silvia Alexandra Reinoso Ortiz, Silvia Verónica Valle-
jo Lara, Paola Natalí Paredes Chinizaca, trabajaron en el desarrollo del proyecto, análisis micro-
biológico, recogida e interpretación de datos y la elaboración del artículo.
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Recibido: 2 de mayo de 2020
Aprobado: 11 de noviembre de 2020
20
cc
BY
NC
ND
Evaluación de la susceptibilidad de Enterococcus faecalis ATCC-29212 frente a medica-
mentos combinados con hidróxido de calcio
Evaluation of the susceptibility of Enterococcus faecalis ATCC-29212 to drugs combined
with calcium hydroxide
https://doi.org/10.37135/ee.04.10.02
Autores:
Doménica Mishelly Rodríguez Robalino1 – https://orcid.org/00000002-0261-4909
Silvia Alexandra Reinoso Ortiz2 – https://orcid.org/00000002-8895-8947
Silvia Verónica Vallejo Lara2 – https://orcid.org/00000001-9857-4157
Paola Natali Paredes Chinizaca2– https://orcid.org/0000-0003-0453-7019
1Centro de Salud Tipo B Guano, Guano, Ecuador
2Universidad Nacional de Chimborazo, Riobamba, Ecuador
Autor de correspondencia: Silvia Alexandra Reinoso Ortiz. Universidad Nacional de Chimbo-
razo. Av. Antonio José de Sucre, Via a Guano. Riobamba, Chimborazo Ecuador. Teléfono:
0998285461. Email: sreinoso@unach.edu.ec
RESUMEN
La elevada incidencia del Enterococcus faecalis en procedimientos odontológicos es un tópico de
interés para el área de la salud, esta bacteria resiste a varios antimicrobianos y su proliferación
aumenta debido a su baja susceptibilidad a sustancias de uso convencional como el hidróxido de
calcio, convirtiéndose en una de las principales causas del fracaso de los tratamientos de conduc-
to. La presente investigación evaluó la susceptibilidad in vitro del Enterococcus faecalis cepa
ATCC-29212 frente a la combinación de sustancias y antibióticos con el hidróxido de calcio. Se
utilizó la técnica de difusión en agar, inoculando el microorganismo en cajas de Petri con agar
Cerebro Corazón (BHI), tratado con discos de papel filtro impregnados con 1µl de cada trata-
miento por triplicado; T1 (Hidróxido de Calcio + propilenglicol), T2 (Hidróxido de Calcio +
paramonoclorofenol), T3 (Hidróxido de Calcio + ampicilina gentamicina + propilenglicol), T4
(Hidróxido de Calcio + Solución Salina Fisiológica), Control positivo (medicamento comercial a
base de Hidróxido de Calcio), se incubó a 35°C durante 24h, los halos formados alrededor de
cada disco fueron medidos y comparados con la escala de Duraffourd y procesados mediante
ANOVA de un factor. Se obtuvo una medida del halo de inhibición de 22,50±3,3 mm, con el trata-
miento T3, siendo sumamente sensible. Concluyendo que este resultó el más efectivo en compa-
ración el resto de la pruebas in vitro en comparación con el resto de los fármaco investigados.
Palabras clave: Enterococcus faecalis, hidróxido de calcio, ampicilina, gentamicina.
ABSTRACT
The high incidence of Enterococcus faecalis in dental procedures is a topic of interest for the
health area. This bacterium resists various antimicrobials and its proliferation increases due to
its low susceptibility to substances of conventional use such as calcium hydroxide, becoming a
of the main causes of root canal failure. The present investigation evaluated the in vitro suscepti-
bility of Enterococcus faecalis strain ATCC-29212 to the combination of substances and antibio-
tics with calcium hydroxide. The agar diffusion technique was used, inoculating the microorga-
nism in Petri dishes with Brain Heart agar (BHI), treated with filter paper disks impregnated
with 1µl of each treatment in triplicate; T1 (Calcium Hydroxide + propylene glycol), T2 (Cal-
cium Hydroxide + paramonochlorophenol), T3 (Calcium Hydroxide + ampicillin gentamicin +
propylene glycol), T4 (Calcium Hydroxide + Physiological Saline Solution), Positive control
(Hydroxide-based commercial medicine Calcium), incubated at 35 ° C for 24h, the halos formed
around each disc were measured and compared with the Duraffourd scale and processed by
one-factor ANOVA. A measure of the inhibition halo of 22.50 ± 3.3 mm was obtained with the
T3 treatment, being extremely sensitive. It was concluded that this was the most effective in
comparison with the rest of the in vitro tests of the rest of the investigated drugs.
Keywords: Enterococcus Faecalis, Calcium Hydroxide, Ampicillin, Gentamicin.
INTRODUCCIÓN
Enterococcus faecalis es un microorganismo anaerobio facultativo, Gram positivo, inmóvil, no
esporulado que coloniza el tracto gastrointestinal y forma parte de la microbiota normal de la
saliva.
(1,2)
Sin embargo, con la aparición de la terapia antibiótica, se ha convertido en un patóge-
no oportunista resistente que puede permanecer dentro de los conductos radiculares incluso
después de la instrumentación endodóntica,
(3,4)
siendo una de las principales causas del fracaso
en el tratamiento de conducto, debido a que componentes estructurales como el colágeno y la
fibronectina ayudan a la adhesión de la bacteria en tejidos y dentina. También favorece la apari-
ción de enfermedades periapicales por su capacidad de apoptosis y piroptosis a las células.
(3,5-7)
Partiendo de que, la eliminación de los microorganismos y la prevención de la reinfección
dentro del conducto radicular es el principal objetivo del tratamiento endodóntico.
(8,9)
En enfer-
medades pulpares severas, la razón primordial del fracaso de un tratamiento de conducto está
dada por que los microrganismos no son erradicados totalmente; tal como ocurre en la necrosis
pulpar debido a un estado de putrefacción del nervio por la presencia de gran cantidad de microorga-
nismos, sin que exista antibacterianos de amplio potencial de eliminación o limpieza deficiente.
(10-12)
Los desechos producidos por Enterococcus faecalis constituyen un factor etiológico de las
enfermedades pulpares, especialmente de la necrosis pulpar. La principal causa de retratamiento
es la eliminación incompleta de ese tejido contenido en un complejo sistema de conductos,
quedando presentes microorganismos en la porción apical de la raíz fundamentalmente.
(1,13,14)
La
obturación inadecuada da la oportunidad a estos microorganismos para que colonicen estas
zonas y sobreviva a los materiales medicamentosos y obtenga alimento.
(9,13)
La presencia de este microorganismo no se manifiesta únicamente en los fallos de tratamientos
endodónticos, En algunos estudios, se ha encontrado en raíces del 70% de los casos de obtura-
ción por periodontitis apical.
(12)
Enterococcus faecalis estuvo presente en el 60% de tratamientos
endodónticos fallidos y en un 25% de piezas dentales sometidas al tratamiento. Se ha observado
que la bacteria tiene la capacidad degradativa similar a la esterasa, pudiendo afectar los compo-
nentes de la resina ocasionando la contaminación de la pieza dental.
(4,15,16)
El Hidróxido de Calcio constituye la sustancia antibacteriana más utilizada en el tratamiento
endodóntico,
(4,7)
debido a que su alto pH destruye la membrana celular bacteriana y las estructu-
ras de proteínas;
(17)
sin embargo, varios estudios demuestran que Enterococcus faecalis puede
ser resistente a varios antibacterianos incluyendo ese medicamento.
(1,4,18)
La eliminación de este
microrganismo por medios convencionales puede llegar a ser poco eficaz, haciéndose necesaria
la investigación de nuevos fármacos que potencien la acción de este o como alternativa terapéutica.
Así, el objetivo de la presente investigación fue evaluar la susceptibilidad in vitro del Enterococ-
cus faecalis ATCC- 29212 frente a la combinación de diferentes sustancias y medicamentos
antimicrobianos (propilenglicol, paramonoclorofenol, ampicilina + gentamicina + propilengli-
col) con Hidróxido de Calcio.
MATERIAL Y MÉTODOS
El presente estudio corresponde a una investigación aplicada, descriptiva transversal y experi-
mental que se desarrolló en el Laboratorio de Microbiología de la Universidad Nacional de
Chimborazo, durante los meses de junio y julio de 2019, cuyo procedimiento metodológico se
describe a continuación.
La actividad antibacteriana se realizó mediante el método de difusión en agar
Los estudios de la actividad antimicrobiana se llevaron a cabo utilizando la técnica de Kirby
Bauer
(19)
mediante el siguiente procedimiento:
1. Se preparó una combinación de diferentes sustancias y medicamentos antimicrobianos
(propilenglicol, paramonoclorofenol, ampicilina + gentamicina + propilenglicol) con
Hidróxido de Calcio a los que se les denominó Tratamientos (T) quedando conformados
de la manera siguiente: T1:Hidróxido de Calcio + propilenglicol, T2: Hidróxido de
Calcio + paramonoclorofenol, T3: Hidróxido de Calcio + ampicilina gentamicina +
propilenglicol, T4: Hidróxido de Calcio + suero fisiológico, el Control positivo fue una
pasta comercial a base de Hidróxido de Calcio.
2. Se utilizó una cepa bacteriana de Enterococcus faecalis ATCC- 29212 que provenía de
un cultivo fresco y puro, obtenido en agar.
3. Del cultivo fresco se preparó un inóculo bacteriano de 1,5 x 108 UFC/mL a partir de la
cepa bacteriana estudiada, el crecimiento bacteriano se ajustó a la turbidez del patrón 0.5
de McFarland.
(20)
4. La muestra bacteriana se obtuvo con un hisopo de algodón estéril introducido dentro del
tubo que contenía el inóculo estandarizado en el paso anterior. El exceso de líquido se
eliminó haciendo rotar suavemente el hisopo contra las paredes del tubo.
5. Con el hisopo debidamente humedecido, se inoculó en tres o cuatro direcciones toda la
superficie de una placa con agar Cerebro Corazón (BHI) girando sucesivamente dicha
placa en ángulos de 90º. Se dejó secar el inóculo a temperatura ambiente durante unos
minutos.
6. La evaluación de la actividad antibacteriana se realizó por triplicado, por lo tanto, en
series de 3 cajas de Petri se colocó con una pinza estéril en forma equidistante sobre la
superficie del agar en cada placa dos discos de papel filtro con 1µl de cada uno de los
tratamientos: T1, T2, T3, T4 y control positivo.
7. Se incubaron las placas en una estufa de cultivo a una temperatura de 35 ºC, en atmósfera
aeróbica.
8. La lectura de las placas se realizó después de 24 horas de incubación, la aparición de
halos de inhibición del crecimiento bacteriano alrededor de los discos permitió determi-
nar la actividad antimicrobiana, se midió el diámetro de los halos de inhibición y se reali-
zó la comparación de los mismos con la escala de Duraffourd,(21) siendo nula (menor o
igual a 8 mm), sensible (de 9 a 14 mm), muy sensible (de 15 a 19 mm) y sumamente
sensible (igual o superior a 20 mm).
Los datos obtenidos fueron procesados empleando el programa en SPSS Statistics 21.0, se reali-
zó un análisis de varianza para comparar múltiples medias ANOVA y método de Tukey para
crear intervalos de confianza en subconjuntos homogéneos, lo que permitió ejecutar compara-
ciones de medias entre los tratamientos (medicamentos combinados con Hidróxido de Calcio) y
elegir al tratamiento con mayor susceptibilidad frente a Enterococcus faecalis cepa
ATCC-29212.
Los investigadores utilizaron las instalaciones de laboratorio certificadas de la Universidad
Nacional de Chimborazo, siguiendo el protocolo establecido de bioseguridad para este tipo de
trabajo. El estudio contó con la aprobación de las comisiones a nivel de las respectivas carrera y
facultad.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Los resultados del estudio in vitro de la actividad antibacteriana de los cuatro tratamientos
propuestos (T1, T2, T3 y T4) y del control positivo (Hidróxido de Calcio pasta) sobre la especie
bacteriana: Enterococcus faecalis ATCC- 29212, permitió establecer la sensibilidad de esa
bacteria ante estos.
Aunque se observó sensibilidad ante cada sustancia utilizada, el tratamiento 3 (T3), empleando
Hidróxido de Calcio + ampicilina gentamicina + propilenglicol, arrojó los resultados más favo-
rables en la terapéutica antibacteriana dirigida al Enterococcus faecalis ATCC- 29212, microor-
ganismo que resultó sumamente sensible (X =22.5 mm) ante ese fármaco según la escala de
Duraffourd
(21)
(tabla 1).
Tabla 1. Sensibilidad de las combinaciones de medicamentos
El análisis de varianza de los valores medios de los halos de inhibición obtenidos al tratar in
vitro a la bacteria estudiada mediante diferentes combinaciones de tratamientos, obteniéndose
un valor de probabilidad significativo (0,002), lo que permite inferir que al menos uno de los
tratamientos comparados fue diferente (tabla 2).
Tabla 2. Análisis de varianza de las medias de los tratamientos
La prueba de Tukey de igualdad de medias de los grupos en subgrupos homogéneos permitió
identificar que el tratamiento 3 (T3) consigue que el diámetro medio de los halos de inhibición
se maximice (tabla 3).
Tabla 3. Igualdad de medias de Tukey
Los resultados de esta investigación concuerdan con los obtenidos en otros estudios,
(22,23,24,25)
en
los que se refiere la existencia de variaciones relativas a la resistencias, intrínsecas o adquiridas
por la bacteria Enterococcus faecalis. La terapia estándar está dada por el uso de ampicilina más
un aminoglucósido, de conjunto esas sustancias permiten un efecto sinérgico que incrementa la
actividad bactericida de los antibióticos.
Gavaldá et al.
(26)
reportan que el tratamiento experimental de la endocarditis resultó ser efectivo
mediante la combinación de ampicilina y gentamicina, con el objetivo de reforzar la acción de
la primera utilizándola de conjunto con otra que inhiba la síntesis de la pared celular del
microorganismo patógeno. Al respecto, también se sugiere el uso de una cefalosporina como la
ceftriaxona cuando existe resistencia adquirida de alto nivel a la gentamicina, anulando la siner-
gia de la unión antibiótica. Esos autores recomiendan la utilización de la combinación de ampi-
cilina más ceftriaxona por ser esta menos nefrotóxica en pacientes con problemas renales.
De acuerdo con el estudio realizado por Causse et al.,
(27)
El Enterococcus faecalis resulta más
sensible ante los betalactámicos como la ampicilina y la amoxicilina más ácido clavulánico, con
un 98% y 99% respectivamente; seguido de los aminoglucósidos como la gentamicina(76%), la
que causó mayor efecto en comparación con la estreptomicina (56%), lo que permite suponer la
existencia de un efecto sinérgico realizar terapia combinada mediante ampicilina y gentamicina,
coincidiendo con los resultados de la presente investigación. El tiempo estimado para que un
medicamento intraconducto cumpla su función oscila entre el tercer día y el séptimo día en
dependencia de la magnitud de la infección, la resistencia bacteriana y la respuesta del organis-
mo del paciente.
CONCLUSIONES
La evaluación in vitro permitió establecer que el tratamiento T3(Hidróxido de calcio + ampicili-
na, gentamicina y propilenglicol) resultó el más efectivo para inhibir al Enterococcus faecalis
cepa ATCC-29212, pudiendo potenciarse su acción a mayor tiempo de exposición. Lo que indica
que constituye una excelente alternativa farmacológica viable en intervenciones intraconducto,
ante una posible resistencia microbiana para evitar fracasos terapéuticos endodónticos.
Conflicto de intereses: los autores declaran no tener
Declaración de contribuciones:
Doménica Mishelly Rodríguez Robalino, Silvia Alexandra Reinoso Ortiz, Silvia Verónica Valle-
jo Lara, Paola Natalí Paredes Chinizaca, trabajaron en el desarrollo del proyecto, análisis micro-
biológico, recogida e interpretación de datos y la elaboración del artículo.
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REE Volumen 15(1) Riobamba ene. - abr. 2021
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
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Recibido: 2 de mayo de 2020
Aprobado: 11 de noviembre de 2020
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